Componente chimicu di tubi spiralati in acciaio inox 347, Identificazione di novi proteini chaperoni di l'antigenu di leucociti umani-A (HLA-A) chì rispundenu à l'interferonu cù spettrometria di massa reticulata (CLMS)

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Descrizzione di u produttu

Tubi in bobina in acciaio inox 347L, qualità d'acciaio: SS347L

U sistema di signalazione di l'interferonu induce una forte risposta di citochine à una larga gamma di segnali patologichi patogeni è intrinseci da l'ambienti, risultatu in l'induzione di sottogruppi di proteine ​​​​inducibili da interferone.Avemu applicatu a spettrometria di massa cross-link mediata da DSS (CLMS) per detectà novi interazzione proteina-proteina in u duminiu di e proteine ​​​​indutte da interferone.In più di e proteine ​​​​inducibili da interferone previste, avemu ancu identificatu novi adduct intermoleculari è intramoleculari cross-linked di proteine ​​​​inducibili da interferone canoniche cum'è MX1, USP18, OAS3 è STAT1.Avemu focu annantu à a validazione ortogonale di un novu settore di rete di proteine ​​​​inducibili da interferone formate da proteine ​​​​HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) utilizendu co-immunoprecipitation è u so studiu ulteriore utilizendu a modellazione di dinamica moleculare.U mudellu di a dinamica conformazionale di u cumplessu di a proteina hà revelatu parechji siti d'interazzione chì riflettenu l'interazzione identificate in i risultati CLMS.Inseme, presentemu un studiu pilotu di CLMS per identificà novi cumplessi di signalazione indotti da interferone, è aspittemu l'usu più largu di CLMS per identificà una nova dinamica di l'interazzione di proteine ​​in u microambientu tumorale.
Prima di l'iniziu di una risposta immune adattativa, u sistema di difesa innata di l'ospite monta una risposta antimicrobiana mediata da una famiglia di citochine alfa-helical secrete chjamate interferoni (IFN).I classi di IFN di tipu I IFNα è IFNβ attivanu risposte cellulari, cumprese stati antivirali, proapoptotichi, proinflamatori è antiproliferativi.In l'omu, 13 sottotipi di IFNα sò cunnisciuti, tutti raggruppati nantu à u cromusomu 91. Sorprendentemente, solu IFNα2 hè statu studiatu per l'usu clinicu.Ricertamenti, una attenzione particulari hè stata pagata à a ricerca nantu à altri sottotipi di IFNα.Un studiu recente hà dimustratu chì l'IFNα14 hè unu di l'isoforme più efficaci in a restrizzione di a replicazione di HBV2 è HIV-13,4 cumparatu cù u subtipu canonicu IFNα2.
Hè statu stabilitu chì i complexi di receptori di l'interferonu di tipu I attivati ​​(IFNAR1 è IFNAR2) attivanu una cascata di trasduzione di signale mediata da Janus kinases TYK2 è JAK15,6.Queste Janus kinases fosforilanu trasduttori di segnali è attivatori di proteina trascrizionale (STAT1 è STAT2) nantu à i residui di tirosina per inizià l'eterodimerizazione mediata da u duminiu SH26.In seguitu, l'IRF9 unisce l'heterodimeri STAT per furmà un cumplessu trimericu di u gene di u fattore 3 stimulatu da IFN (ISGF3), chì si trasloca à u nucleu è induce a trascrizione di più di 2000 geni stimulati da interferone (ISG)5,6,7,8.
ISG formanu a spina dorsale di u sistema immune innatu, in particulare in risposta à l'attaccu virali.Cum'è una prima linea di difesa contr'à l'infezzione virali, e cellule implementanu rapidamente interazzione estensiva di proteine ​​​​cellulari cù una larga gamma di attività biologiche.Queste proteini includenu receptori di ricunniscenza di mudelli, molécule di signalazione, fatturi di trascrizione è proteine ​​​​con funzioni antivirali dirette, è ancu regulatori negativi di risposti immune9.A maiò parte di l'infurmazioni nantu à l'attività ISG vene da schermi funzionali chì utilizanu schermi di sovraespressione10,11 o tecniche di silenziu di gene (siRNA, RNAi è CRISPR)12,13 in quale ISG individuali sò espressi o inibiti è a so attività hè pruvata nantu à diversi virus.Ancu se sti studii anu determinatu e proprietà antivirali di ISG individuali, i meccanismi molecolari sottostanti di ogni ISG restanu largamente scunnisciuti.Hè generalmente accettatu chì parechje proteine ​​​​interagiscenu cù una o più citochine per assicurà a piena attività, cusì o ISG interagiscenu direttamente o e so interazzione sò mediate da e proteine ​​​​cellulari.Per esempiu, un studiu recente di proteomica photocrosslinked identificò ATPase VCP / p97 cum'è un cumpagnu d'interazzione maiò IFITM3, chì a so inhibizione porta à difetti in a classificazione lisosomiale, u turnover, è u cotransport di IFITM3 cù particeddi virali 14 .Utilizendu l'immunoprecipitazione, avemu identificatu VAPA, una proteina assuciata à a vesicula, cum'è un cumpagnu d'interazione cù IFITM1/2/3 chì mediate a maturazione virali mediata da u colesterolu, è questu hè statu cunfirmatu da un altru studiu chì utilizeghja un sistema di lievitu à dui ibridi.Supportu Scientificu 15 , 16 .
Un prucessu biologicu fundamentale implicatu in a suppressione di l'infezzione è a trasformazione maligna hè a presentazione di l'antigenu, chì hè mediata da molécule di complexi di histocompatibilità maiò (MHC).Peptidi (8-12 aminoacidi longu) da e proteine ​​​​clivate, terminate prematuramente o misfolded sò caricati in l'heterodimer MHC-I (custituitu di catene pesanti è ligeri MHC-I, chjamati β-2-microglobulina; β2M) 17,18.I trimeri MHC-I stabili risultanti sò trasportati à a superficia cellulare, induve presentanu peptidi intracellulari à e cellule T CD8 + (cellule T citotossiche)17.I cellule T ricunnoscenu è distrughjenu questi patogeni è e cellule chì portanu un antigenu specificu di tumore.In cunseguenza, i patogeni è e cellule tumorali spessu supprimenu u prucessu di presentazione di l'antigenu per evità a vigilazione immune.Inoltre, l'MHC-I hè rigulatu in u 40-90% di i tumuri umani è hè spessu assuciatu cù un prognosi più poviru19.
I geni implicati in a risposta à i patogeni anu da cambià rapidamente trà un statu di riposu è un statu di trascrizione attiva.Per quessa, parechji proteini cellulari sò ipotizzati per esse implicati in a risposta à una alta dumanda di IFN in brevi periodi di tempu, cumprese a remodelazione è a mudificazione di a cromatina promotrice 20,21.A maiò parte di i studii anu focu annantu à l'identificazione di i partenarii di proteini ISG individuali in presenza di IFN.Diversi studii proteomici è transcriptomici in sistemi di cellula mudellu anu elucidatu l'effettu di IFN nantu à u paisaghju cellulare.In ogni casu, malgradu una cunniscenza crescente di a dinamica indotta da interferoni, sapemu ancu pocu di l'implicazione di l'ISG.Quandu si cunsiderà a cumplessità è a dinamica dipendente da u tempu di a signalazione di l'interferonu, si ponenu duie dumande: (i) hè pussibule stabilizzà è intrappulà i cumplessi multiproteini implicati in a signalazione rapida, è (ii) ponu esse mappate queste interazzione in u spaziu 3D?
Per affruntà questi prublemi, avemu implementatu a reticulazione chimica mediata da suberate di disuccinimide (DSS) accumpagnata da spettrometria di massa (CLMS) per studià a reta di interazione di proteine ​​​​indotta da IFNα è a so dinamica.DSS aghjunghje ligami covalenti trà residui proximali di proteine ​​​​è / o cumplessi di proteini in vivo.L'analisi MS successiva revela siti specifichi di crosslinking chì riflettenu a vicinanza spaziale di e regioni in una proteina particulari, chjamati ligami interni, o subunità in cumplessi di proteine ​​​​, chjamati interrelazioni.Aduprendu stu approcciu, avemu identificatu parechji novi cumplessi proteini-proteini è ancu e rete d'interazzione multiproteina indotta da interferone.Testendu ulteriormente un sottogruppu di sti novi interazzioni, dimustremu chì H2BFS (H2B histon-type FS; in seguitu chjamatu H2B) è MDN1 agisce cum'è partenarii di ubligatoriu per HLA-A.
Les cellules Flo-1 sont l'un des modèles in vitro les plus connus d'adénocarcinome de l'œsophage car ils imitent les caractéristiques clés des tumeurs de l'œsophage22,23.Tuttavia, micca tutti i tumori sò immunogeni, è per stabilisce se e cellule Flo-1 rispundenu à u trattamentu di l'interferonu, avemu trattatu e cellule Flo-1 cù 10 ng/ml IFNα per 72 ore.I celluli Flo-1 dimustranu l'induzione precoce di pSTAT1 è IRF1, cuminciendu 2 ore dopu à u trattamentu è cuntinuendu per 72 ore, cù una diminuzione dipendente di u tempu in i livelli stazionarii di IRF1 (Figura 1A).ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2, è ISG15) sò stati trovati forti indotti dopu à 6 ore, mimiting the classic mid and late phase responses to IFNα (Figura 1A).Inseme, sti dati suggerenu chì stu mudellu cellulare pò esse usatu per studià e risposti di interferone.
Risposte di espressione di proteina differenziale in cellule Flo-1 dopu u trattamentu IFNα.(A) L'espressione di proteine ​​​​in cellule Flo-1 trattate cù 10 ng / ml IFNα per 2, 6, 24, 48 è 72 ore hè stata analizata da immunoblot cù l'anticorpi ISG indicati.(B) Gel SDS-PAGE macchiato di blu Coomassie di estratti di cellule intere dopo a reticolazione con DSS per i tempi e le concentrazioni indicate.(C) Immunoblot rappresentante esaminatu cù l'anticorpu p53 (DO-1) da i stessi campioni per valutà u gradu di reticulazione di a proteina.
Per catturà u paisaghju di l'interazzione di a proteina in situ, avemu usatu DSS, un agentu di reticulazione largamente utilizatu per via di a so alta permeabilità di a membrana è di u tempu di reazione relativamente breve.U tempu di reazione più brevi aiuta à prevene a furmazione di grandi aggregati di proteine ​​​​crosslinked, mantenendu cusì a stabilità di u crosslinker.Per determinà a cuncentrazione ottima di DSS è evità l'over-crosslinking, avemu prima espunutu e cellule à 5, 2.5, è 1 mM DSS per 5, 10, 5, è 30 minuti, rispettivamente, è analizà i lisati da Coomassie-stained SDS-PAGE. (dati micca mostrati).I lisati cellulari parenu esse altamente reticulati à a cuncentrazione più bassa è à u puntu di tempu più cortu.Dunque, DSS hè stata titrata à 1, 0,5 è 0,1 mM in 5 minuti (Figura 1B).A reticulazione ottimale hè stata osservata cù 0.5 mM DSS per 5 minuti, è sti cundizioni sò stati scelti per e cellule trattate cù IFNα.Inoltre, a Figura 1C mostra un Western blot realizatu cù l'anticorpu p53 (DO-1) per valutà u gradu di reticulazione di a proteina.
E cellule Flo-1 sò state trattate cù 10 ng/ml IFNα per 24 ore prima di aghjunghje u reticulatu.I celluli cross-linked sò stati successivamente lysed by proteolysis two-step è i proteini sò stati processati da FASP (Fig. 2) 24,25.I peptidi tryptic cross-linked sò stati analizati per spettrometria di massa (Fig. 2).I spettri MS / MS sò allora appiccicati à a sequenza di a proteina è quantificati cù MaxQuant26,27.I peptidi cross-linked sò stati identificati da i spettri ottenuti cù u prugramma SIM-XL, è i composti individuali sò stati cumminati in una reta cumplessa utilizendu i pipeline di software di computing open source xQuest28 è SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL identifica l'interazzione proteina-proteina, catene internu è catene individuali in miscele di proteine ​​​​simplice o cumplesse è furnisce script per visualizà l'interazzione in strutture di proteina.Inoltre, classifica ogni riferimentu incruciatu cum'è un puntu di ID secondu a qualità di spettru MS / MS29.Diversi interazzione proteini-proteini assai affidabili è cumplessi sò stati identificati, è un novu settore d'interazzione hè statu investigatu in più utilizendu co-immunoprecipitation è cambiamenti conformazionali di cumplessi utilizendu mudeli di dinamica moleculare (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Panoramica schematica di u metudu CLMS.E cellule Flo-1 sò state trattate cù 10 ng/ml IFNα per 24 ore seguite da una reticulazione di proteine ​​​​in situ cù DSS seguita da lisi cellulare è tripsinizazione.I campioni cross-linkati sò stati analizati cù un spettrometru di massa Orbitrap è più campionati per a frammentazione di i precursori di peptidi durante LC-MS / MS.Dui peptidi ligati sò stati identificati da i spettri ottenuti utilizendu u prugramma Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL), è tutti i cumposti sò stati cumminati in una reta cumplessa utilizendu pipeline computazionali.Filtrà l'interazzioni di bassa fiducia basate nantu à punteggi di falsi positivi (FDR).Diversi novi interazzioni di proteina-proteina d'alta fedeltà sò stati cunfirmati ulteriormente cù a co-immunoprecipitation, è i cambiamenti conformazionali in i cumplessi sò stati esaminati cù a mudelazione di dinamica moleculare (MD).
Un totale di ~ 30,500 è ~ 28,500 peptidi sò stati rilevati cù MaxQuant in campioni IFNα stimulati è stimulati, rispettivamente (Table Supplementary S1, Fig. 3A).A distribuzione di lunghizza di peptide in i dui casi dimustrava una proporzione più altu di peptidi più grossi, chì indicanu a prisenza di peptidi cross-linked (Fig. 3B, C).Inoltre, una proporzione più grande di peptidi più grande eranu prisenti in a gamma 40-55 in i mostri trattati cù IFNα (Fig. 3C).A mappatura di a proteina contr'à l'intensità di log2 hà dimustratu chì e proteini classiche stimulate da interferone eranu i più abbundanti cumparatu cù i campioni micca trattati, cumprese MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 è HLA-F (Figura 3D).L'analisi di i percorsi per e proteine ​​​​più di trè volte arricchite in risposta à u trattamentu IFNα utilizendu a basa di dati di a via Reactome hà dimustratu chì a presentazione è u processu di l'antigenu mediatu da MHC-I era a via più dominante (Figura 3E).In cunfurmità cù i rapporti precedenti, e risposte antivirali mediate da OAS è ISG15, è ancu IFNα/β è signalazione di citochine eranu trà e vie attivate.Inoltre, i ligami incrociati di proteine ​​​​specifici di lisina è serina sò stati identificati da i spettri MS / MS acquistati in origine cù SIM-XL.Un studiu recente hà riportatu 104 ISG chì coprenu 20 virus da 9 classi di virus per meta-analisi di studii individuali di sovraespressione ISG in 5 tipi di cellule9.In ogni casu, per superà e limitazioni computazionali di screening di grande datasets, avemu principiatu cù un dataset più chjucu per spiegà e pussibuli interazzione trà a lista di geni IRDS riportati da Padaria et al., a maiò parte di i quali sò ISG.
Identificazione di proteine ​​​​reticulate espresse di manera differenziale in risposta à IFNα (dati ottenuti da MaxQuant).(A) Diagramma di Venn chì rapprisenta u numeru di peptidi cumuni è esclusivi identificati in campioni Flo-1 trattati è micca trattati IFNα14.Distribuzione di lunghezza peptidica di campioni reticulati non trattati (B) è trattati IFNα (C).(D) Mappa di calore chì rapprisenta log2 (intensità LFQ) trà e cellule Flo-1 trattate cù IFNα14.U pannellu di manca mostra i proteini più attivamente attivati ​​in presenza di IFNα.(E) Histogramma chì rapprisenta i 20 percorsi principali di arricchimentu dopu u trattamentu IFNα.A basa di dati di a via Reactome analizò più di quattru cambiamenti in e proteine ​​​​risposti à IFNα upregulated.
A stimulazione ISG mediata da interferone hè ben documentata, ma à u livellu molekulari hè pocu cumpresu cumu queste proteini culminate in una larga gamma di funzioni biologiche.Avemu investigatu l'interazzione di proteine ​​​​cun un altu gradu di cunfidenza trà ISG cunnisciuti.Curiosamente, avemu identificatu una rete chì includenu MX1, USP18, ROBO1, OAS3 è proteini STAT1 chì formanu un grande cumplessu in risposta à u trattamentu IFNα (Figura 4, Table S2) 32,33,34.U più impurtante, sti interazzioni sò stati truvati in tutti i triplicati trattati cù IFNα è ùn sò micca stati truvati in campioni micca trattati, chì suggerenu chì sò stati formati specificamente in risposta à u trattamentu IFNα.Hè cunnisciutu chì STAT1 regula transcriptionally l'espressione di sti ISG, ma a so interazzione cù ISG à u nivellu di prutezione ùn hè micca stata studiata.A struttura cristallina di STAT1 hà dimustratu chì u so duminiu elicoidale (CCD) ùn hè micca implicatu in l'interazzione cù DNA o protomers durante a furmazione di dimeri35.Queste α-elice formano una struttura elicoidale elicoidale che fornisce una superficie prevalentemente idrofila per le interazioni che si verificano 35 .In i nostri dati CLMS, avemu osservatu chì a maiò parte di l'interazzione cù STAT1 hè accadutu in u duminiu SH2 chì precede u CCD, u duminiu di linker, o a cuda C-terminale (residui 700-708) (Figura 4A).Un studiu precedente hà infurmatu chì USP18 s'unisce à u duminiu CCD è DNA-binding (DBD) di STAT2 è hè reclutatu à a subunità di u receptore di l'interferonu di tipu I IFNAR2 per mediate l'inhibizione di a signalazione di l'interferon di tipu I 24 .I nostri dati anu ancu dimustratu chì u duminiu cataliticu USP18 interagisce cù STAT1 DBD (Figura 4A, D), chì suggerenu chì STAT1 è STAT2 puderanu ghjucà un rolu in l'attrazione di USP18 à IFNAR2.
Rete ISG proteina-proteina identificata in cellule reticulate trattate cù IFNα.(A) Trama di interazione 2D chì mostra l'interazzione proteina-proteina (generata in u prugramma SIM-XL), cù linee chì rapprisentanu interazioni intermoleculari (cutoff crosslink impostatu à 3.5).Duminii di diverse identità sò marcati da u so culore32: duminiu MX1, Dynamin_N (73-249), Dynamin_M (259-547) è GED (569-660).Domini OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), è OAS1_C (903-108).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) è fn3 (777–864).Campi STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), è STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Circular viewer of cross-linked proteins (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, and STAT1) cù interazzione è interazzione marcate in blu è rossu, rispettivamente.U limitu di cross-link hè statu stabilitu à 3,5.Dot plots indicanu siti d'interazione STAT1 cù MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) è OAS3 (F), è ancu siti di interazzione K o S trà i dui peptidi.In a figura, u limitu di puntuazione cross-link hè stabilitu à 3.0.(G) Diversi siti d'interazzione trà i domini STAT1 è OAS3 DI sovrapposti à e so strutture di prutezione in PyMol (sistema di grafica moleculare PyMOL, versione 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) è OAS3 (pdb id: 4s3n34).) prugramma.
Dui isoformi di USP18 sò stati descritti in l'omu, una proteina full-length chì si trova principarmenti in u nucleu, è una isoforma senza un duminiu N-terminale, USP18-sf, chì hè distribuitu uniformemente in u citoplasma è u nucleu 36 .Inoltre, u N-terminale hè statu previstu per esse micca strutturatu è ùn hà micca bisognu di l'attività di isopeptidase o di l'ISG1537.A maiò parte di l'interazzione identificate in u nostru studiu sò stati situati à u N-terminale di a proteina, chì suggerenu chì queste interazzione implicanu USP18 full-length (Figura 4A, D) è cusì prubabilmente accade in u nucleu.Inoltre, i nostri dati indicanu ancu chì l'N-terminale hè specializatu per l'interazzione proteina-à-proteina.U situ di ubligatoriu di IFNAR2 hè situatu trà i residui 312-368, è in particulare, nimu di e proteini in u cumplessu ligate à sta regione (Fig. 4A) 37,38.Questi dati pigliati inseme indicanu chì u duminiu di ubligatoriu IFNAR2 hè solu utilizatu da a proteina di u receptore.Inoltre, solu OAS3 è ROBO1 sò stati truvati per esse assuciati cù domini upstream di u N-terminale è u situ di ubligatoriu IFNAR2 (Figura 4A).
ROBO1 appartene à a superfamiglia di immunoglobuline (Ig) di e molécule di segnalazione transmembrana è hè custituita da cinque domini Ig è trè domini di fibronectina (Fn) in a regione extracellulare.Questi duminii extracellulari sò seguiti da una regione proximali di a membrana è una sola helix transmembrana 39. Una regione intracellulare non strutturata hè situata à u C-terminale è cuntene motivi di sequenza cunservati chì mediate u ligame di a proteina effector39.A regione chì si estende da aminoacidi ~ 1100 à 1600 hè soprattuttu disordinata.Avemu trovu chì MX1 interagisce cù ROBO1 attraversu Ig, Fn è duminii intracellulari, mentri a maiò parte di l'interazzione cù STAT1 si trovanu trà u so CCD, u duminiu di linker, è u C-terminus di ROBO1 (Fig. 4A, E).Per d 'altra banda, l'interazzione cù e regioni linker DI, DIII è OAS3 sò stati distribuiti in tutta a proteina ROBO1 (Fig. 4A).
A famiglia di a proteina oligoadenylate synthase (OAS) accetta è unisce l'RNA intracellulare à doppia fila (dsRNA), subisce cambiamenti conformazionali, è sintetizza oligoadenylates ligati à 2',5' (2-5 As) 40 .Hè stata truvata chì trà e trè OAS, OAS3 exhibe a più alta affinità per dsRNA è sintetizza a quantità minima di 2-5 As, chì pò attivà RNase L è cusì limità a replicazione virali 41 .A famiglia OAS hè custituita da domini di nucleotide transferasi simili à polimerasi beta (pol-β).Ricerche precedenti anu dimustratu chì l'attività catalitica di u duminiu C-terminale (DIII) hè dipendente da u duminiu dsRNA-binding (DI), chì hè necessariu per l'attivazione di OAS342.Avemu osservatu chì i domini DI è DII di OAS3 interagiscenu cù CCD è una piccula regione di junzione trà SH2 è STAT1 TAD (Figura 4A, F).Overlaying different crosslinking sites on the protein structure reveled an interaction between the β-sheet and DBD STAT1 loop and an open pocket or cavity formed by residues 60-75 in the DI domain of OAS3 (Fig. 4G).L'orientazione di e proteini in u cumplessu hà ancu indicatu chì nimu di l'interazzione cù OAS3 interferiscenu cù l'abilità di ubligatoriu di DNA di u so duminiu DI (Fig. S1A).Inoltre, u duminiu N-terminale di GTPase MX1 interagisce assai cù i domini DI è DIII di OAS3 (Fig. 4A).Avemu ancu osservatu una interazzione trà OAS1 è MX1 in tutti i trè ripetizioni trattati IFNα, induve un unicu duminiu OAS1 (ancu cataliticamente attivu) interagisce cù tutti i trè domini MX1 (Figura S2A, B).
I proteini MX sò parti di una grande famiglia di GTPasi simili à dineina chì cuntenenu un duminiu GTPasi N-terminale chì unisce è idrolizza GTP, un duminiu intermediu chì mediate l'auto-assemblea, è un zipper di leucina C-terminale chì agisce cum'è GTPasi (LZ). ).duminiu efectu di duminiu 25,43.MX1 si unisce à subunità di polimerasi virali per bluccà a trascrizione di u genu virali43.Un schermu di dui ibridi di lievitu rappurtatu prima hà dimustratu chì MX1 assuciatu à PIAS1 inibisce l'attivazione di u gene mediata da STAT1 bluccà l'attività di legame à l'ADN è hà ancu attività SUMO E344,45 ligase.Quì, dimustremu chì MX1 si lega à STAT1 (Figura 4C, D), ma cumu questa interazione affetta l'attivazione di geni mediata da STAT1 in risposta à IFNα hà bisognu di più studiu.Inoltre, avemu trovu ancu chì MX1 interazzione cù IFIT3 è DDX60 in tutti i trè IFNα-treated repeats (Fig. S2C).
DDX60 hè una elicasi citoplasmatica indotta da IFN chì hè stata rappurtata per ghjucà un rolu in a degradazione indipendente da RIG-I di l'RNA46 virali.Interagisce cù RIG-I è attivate a so signalazione in un modu specificu di ligand 46. DDX60 hè custituitu da un duminiu di l'helicase DEXD / H-Box è un duminiu di l'helicase C-terminale chì unisce l'RNA virali è l'ADN47.A maiò parte di e so interazzione cù MX1 è IFIT3 si trovanu in longu regioni N- è C-terminali senza domini canonichi o motivi (Fig. S2E, F).In ogni casu, MX1 hè ancu assuciatu cù u duminiu di l'helicase DEXD / H-Box (Fig. S2E).Prutiini di a famiglia IFIT anu copie in tandem di un motivu distintivu di l'helix-turn-helix chjamatu u tetrapeptide repeat (TPR).IFIT3 hè statu truvatu per esse un modulatore pusitivu di a signalazione RIG-I è dunque un cumpunente di u cumplessu MAVS.Inseme, i nostri dati suggerenu chì IFIT3 è DDX60 interagisce principarmenti in a regione trà TPR 3-6 di IFIT3 è pò ghjucà un rolu in a signalazione RIG-I / MAVS (Fig. S2F).
Siccomu u screening di tuttu u proteoma hè intensivu di calculu, avemu allora esaminatu tutta a basa di dati UniProt umana per a presenza di una di e ripetizioni trattate cù IFNα.In questa replica, avemu trovu parechje rete d'interazione altamente affidabili per HLA-A.L'analisi di i percorsi di prutezione identificati da i spettri MS / MS hà dimustratu chì u processu è a presentazione di l'antigenu basatu in MHC-I hè a via principale indotta da l'interferonu (Fig. 3D).Dunque, avemu focu annantu à studià l'interazzione di prutezione di e molécule MHC-I cun un altu gradu di cunfidenza in tutti i campioni cross-linked.L'HLA è costituito da domini α1, α2 e α3 e catene leggere, e la microglobulina β2 (β2m) è una proteina chaperone costante49.Una volta assemblatu in u reticulum endoplasmaticu, HLA hè instabile in assenza di ligandi peptidici50.U groove di legame di peptide hè furmatu da i duminii α1 è α2 altamente polimorfi è non strutturati in forma non peptidica è u duminiu α351 relativamente menu polimorfu.In presenza di IFNα, avemu rilevatu dui complexi HLA-A: unu interagisce cù HMGA1 è H2B (Figura 5, Table S3) è l'altru interagisce cù MDN1, LRCH4 è H2B (Figura 6).
IFNα induce una rete di interazione HLA-A con H2B (H2BFS) e HMGA1.(A) Trama 2D (generata in u software SIM-XL) chì rapprisenta diversi tipi d'interazzione in u cumplessu H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (blu), interlink (red) è single link (neru)..Duminii di diverse identità sò codificati in culore32: H2B (histone; 2-102) è MHC-I (MHC_1; 25-203, gruppu C1; 210-290 è MHC_I_C; 337-364).U limitu di cross-link hè statu stabilitu à 3,5.Dot plots indicanu siti di interazzione HLA-A cù H2B (B) è HMGA1 (C), è ancu siti di interazzione K o S trà i dui peptidi.In a figura, u limitu di puntuazione cross-link hè stabilitu à 3.0.(D) Relazioni trà e proteine ​​​​dimustrate in e strutture di e proteine ​​​​H2B, HLA-A è HMGA1 in u prugramma PyMOL.Queste strutture sò state modellate cù u servitore Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) è e strutture di mudellu per e proteine ​​​​H2B, HLA-A è HMGA1 eranu 1kx552, 1kj349 è 2eze55, rispettivamente.
IFNα induce una rete di interazione HLA-A con H2B (H2BFS), MDN1 e LRCH4.(A) Crosslinks intramolecular (rossu) è intermolecular (blu) presentati nantu à una mappa interattiva 2D (generata in u software SIM-XL) cù MDN1 rapprisintatu cum'è un cerculu.U limitu di cross-link hè statu stabilitu à 3,5.Duminii di diverse identità sò codificati in culore32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, gruppu C1; 210–290 è MHC_I_C; 337–364) è LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137-194) è CH (535-641)).(B) Relazioni trà e proteini mostrati in e strutture di e proteine ​​​​H2B, HLA-A, LRCH4 è MDN1 in u prugramma PyMOL.Queste strutture sò state modellate cù u servitore Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) cù strutture di mudelli 1kx552, 1kj349, 6hlu62 è 6i2665 per e proteine ​​​​H2B, HLA-A, LRCH4 è MDN1, rispettivamente.Dot plots chì mostranu siti di interazione K o S per HLA-A cù H2B (C), LRCH4 (D) è MDN1 (E).Per i plots, u limitu di puntuazione cross-link hè statu stabilitu à 3.0.
In più di mantene l'integrità di u genoma, l'histone H2B hè ancu implicatu in a regulazione di a trascrizione.La proteina H2B è costituita da un dominio istone centrale (HFD) formato da tre eliche α separate da anelli e una coda C-terminale 41,52.A maiò parte di l'interazzione cù H2B si trova in l'hélice α1, chì furnisce trimerizazione cù l'heterodimeru HFD (Fig. 5A, B).Ancu se lisine sò implicati in l'associazione di DNA, alcune lisine sò ancu siti alternativi di acetilazione o metilazione.Per esempiu, i residui K43, K46, è K57 da H2B ùn sò micca implicati in u ligame direttu à l'ADN, ma sò mira di diverse modificazioni post-trascrizionali53.In listessu modu, i residui K44, K47 è K57 in H2B pò ghjucà un rolu alternativu in a presenza di IFNα, cumprese l'interazzione cù altre proteini (Fig. 5A, B).Inoltre, l'istone extracromosomale H2B attiva a risposta immune in diversi tipi di cellule, agiscenu cum'è un sensoru citosolicu per detectà frammenti di DNA a doppia fila (dsDNA) derivati ​​​​da agenti infettivi o cellule danneggiate54.In presenza di virus DNA, l'esaurimento di H2B inibisce la produzione di IFN-β e la fosforilazione di STAT154.H2B hè ancu cunnisciutu per muvimenti in è fora di u nucleu più veloce di l'altri histones core54.L'interazzione H2B cù MDN1 è LRCH4 sò stati ancu osservati in campioni selezziunati micca trattati.Avemu trovu chì HLA-A interagisce cù H2B in tutti i trè campioni trattati cù IFNα è in una mostra ripetuta micca trattata.Questi dati riflettenu u rolu di H2B in una funzione fisiologica alternativa indipendente da a regulazione trascrizionale.
HMGA1 (gruppu di alta mobilità AT-Hook 1), una piccula nucleoproteina ricca in aminoacidi chì prumove a malatia, hè stata identificata in associazione cù HLA-A.Havi una coda C-terminale acida è trè DBD distinti chjamati AT hooks perchè si liganu à u groove minore di a regione ricca in AT in dsDNA55,56.Questa unione face chì l'ADN si piega o stende, chì permette à i fatturi di trascrizzione canonichi accede à a so sequenza di cunsensu.Si crede chì a coda C-terminale hè implicata in l'interazzione proteina-proteina è u reclutamentu di fattori di trascrizzione, postu chì i mutanti di eliminazione C-terminale ùn sò micca capaci di inizià a trascrizione57.Inoltre, stu duminiu cuntene parechji siti di fosforilazione cunservati chì sò cunnisciuti sustrati per kinases 58 .Avemu osservatu l'interazzione HLA-A è H2B cù HMGA1 fora di u duminiu C-terminale, chì suggerenu chì u duminiu C-terminal hè principarmenti utilizatu per u factor di trascrizione (Fig. 5A, C).E proteine ​​​​HMGA competenu cù l'istone H1 per u ligame à l'adattatore di DNA, aumentendu cusì l'accessibilità57.In listessu modu, pare chì HMGA interagisce cù l'histone H2B longu u DNA di linker in cumpetizione cù l'histone H1.HMGB1 induce l'espressione di HLA-A, -B è -C in e cellule dendritiche, purtendu à a so attivazione59, ma una interazzione trà HMG è HLA ùn hè micca stata rappurtata prima.Avemu trovu chì HMGA1 interagisce cù i domini α1 è α3 di HLA-A, cù a maiò parte di l'interazzione fora di u so 3 DBD (Figura 5A, C).In e nostre mani, HLA-A hè stata trovata in u nucleu (dati micca mostrati), è datu chì H2B è HMGA1 sò ancu prisenti in u nucleu, sta interazzione prubabilmente si trova in u nucleu.Adducts specifichi misurati trà H2B, HLA-A è HMGA1 sò mostrati in Figura 5D.
A maiò parte di l'interazzione di HLA-A cù altre proteini sò in i so domini α1 è α2 è u duminiu C-terminal disordinatu (Fig. 6).In unu di questi esempi, avemu trovu chì HLA-A interagisce cù a coda N-terminale disordinata di LRCH4 (Figura 6A, D).LRCH4 regula l'attivazione di TLR4 è l'induzione di citochine LPS, modulendu cusì a risposta immune innata60,61.Hè una proteina di membrana cù nove ripetizioni ricche di leucina (LRRs) è un mutivu di omologia di calmodulina (CH) in u so ectodomain, seguitu da un duminiu transmembrana (TMD) 60, 62 .I domini CH sò stati rappurtati per mediate l'interazzione proteina-proteina 60 .Un trattu di circa 300 aminoacidi trà i domini LRR è CH hè relativamente accessibile ma disordinatu.Basatu nantu à a funzione di e regioni disordinate cum'è mediatori di e rete di proteina-proteina è u trasportu vesicular 63, truvamu chì a maiò parte di l'interazzione di prutezione si trovanu in regioni disordine.L'interazzione cù MDN1 sò stati distribuiti in tutta a durata di a proteina, cumpresi i domini LRR1, LRR6, CH è e regioni aleatorii, mentri H2B principarmenti ligatu à u duminiu CH (Fig. 6A, B).In particulare, nimu di l'interazzione includeu l'ATM, suggerendu a specificità di l'approcciu CLMS (Figura 6A, B).
MDN1 hè statu ancu identificatu cum'è parte di a reta di a proteina HLA-A (Figura 6A).Appartene à a famiglia di proteini AAA (ATPasi assuciati cù diverse attività).Questu hè u stessu duminiu AAA N-terminale chì urganizeghja in un anellu hexamericu è sguassate u fattore di assemblea da a subunità ribosomiale 60S 64.pare esse simili à a dynein64,65,66.Inoltre, a regione ricca Asp / Glu hè seguita da u duminiu MIDAS (situ dipendente di ioni di metalli).A causa di a grande dimensione di MDN1 (circa 5600 aminoacidi) è a so omologia limitata cù e proteine ​​​​ben studiate, pocu hè cunnisciutu di a so struttura è a funzione in l'omu.Avemu identificatu HLA-A, H2B è LRCH4 cum'è partenarii di ubligatoriu MDN1 è palesa a so orientazione cum'è complexi di proteini in PyMol (Fig. 6A, B).Queste trè proteini interagiscenu cù u duminiu AAA, u duminiu di linker di dineina, è possibbilmente u duminiu MIDAS MDN1.In un rapportu precedente, a purificazione di l'affinità di e proteini di l'esca identificanu MDN1 cum'è una proteina assuciata à l'histone H2B67.Inoltre, un studiu recente hà riportatu ancu una interazione trà MDN è HLA-B in cellule HCT116 utilizendu spettrometria di massa purificata per affinità, chì sustene i nostri risultati68.L'identificazione di stu cumplessu in campioni trattati cù IFNα suggerisce un rolu per MDN1 in a signalazione di l'interferon.
Perchè i geni HLA sò altamente polimorfichi, avemu estratto a sequenza di leghje mapping HLA-A, -B è -C da i dati di sequenza di l'RNA di e cellule Flo-1 (dati micca mostrati).Sequenze di peptidi coerenti cù a lettura di sequenza anu revelatu differenze significative trà HLA-A, -B è -C in e regioni induve i peptidi cross-linked eranu situati in HLA-A (Figura S3).Inoltre, ùn avemu micca osservatu a proteina-à-proteina cross-linking di molécule HLA-B/C cù proteini H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Questu suggerisce chì l'interazione di a proteina truvata trà HLA-A, MDN1, LRCH1 è HMGA1 hè HLA-A specificu.Inoltre, l'analisi proteomica di campioni non reticulati (Table S4) hà dimustratu chì HLA-A hà una cobertura di sequenza più altu cumparatu cù HLA-B o HLA-C.I peptidi identificati per HLA-A eranu alta in intensità in i campioni trattati cù IFNα è micca trattati.
Per assicurà chì l'interazzione identificate quì ùn sò micca dovute à una reticulazione non specifica di duie proteine ​​​​in una vicinanza spaziale stretta, avemu cunfirmatu ancu dui novi fattori interattivi HLA-A eseguendu test di co-immunoprecipitation.L'interazzione HLA-A cù MDN1 è H2B endogeni sò state rilevate in e cellule Flo-1 trattate cù IFNα è micca trattate (Figura 7, Figura S4).Avemu cunfirmatu chì HLA-A hè stata catturata da H2B in l'immunoprecipitati è chì sta associazione era duvuta à u trattamentu IFNα postu chì HLA-A era assente in i campioni di immunoprecipitate da cellule non trattate (Figura 7A).Toutefois, nos données suggèrent que l'IFNα régule différemment la liaison HLA-A à H2B et MDN1.L'IFNα induce l'associazione trà H2B è HLA-A, ma riduce a so associazione cù MDN1.Avemu trovu chì MDN1 era assuciatu cù HLA-A in i cuntrolli, è l'aghjunzione di IFNα hà riduciutu sta interazione indipendente da l'induzione MDN1 da IFNα (Figura 7B, C).Inoltre, l'immunoprecipitazione HLA-A capturò H2B in i celluli A549 (Fig. S4), chì suggerenu chì sta interazzione hè indipendente di u tipu di cellula.Inseme, questi risultati sustene l'interazzione mediata da interferone di HLA-A cù H2B è MDN1.
HLA-A co-purifica H2B è MDN1.Immunoblots H2B (A) è MDN1 (B) endogeni rappresentativi sò stati immunoprecipitati da cellule Flo-1 trattate cù IFNα è sondati per l'anticorpi indicati.IgG di mouse è cunigliu sò stati utilizati com'è cuntrollu negativu.(C) Quantità relative (input) di diversi antigeni sò raffigurati da immunoblots sondati contr'à l'anticorpi indicati, a β-actina hè stata aduprata cum'è cuntrollu di carica.
E proprietà strutturali di una di e rete cross-linked altamente affidabili indotte da interferone, H2B-HLA-A-HMGA1, sò state investigate.Avemu usatu a modellazione di dinamica molekulari cum'è un approcciu alternativu per capisce a dinamica conformazionale di e proteine ​​​​implicate in stu cumplessu (Figura 8).Inferenzi da i dati CLMS suggerenu a pussibilità di diverse cunfurmazioni di e proteine ​​​​H2B, HLA-A è HMGA1.Per quessa, i seguenti cumplessi potenziali sò stati modellati in un mediu solvente: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A è H2B-HLA-A-HMGA1.Un schermu di docking di proteina-proteina iniziale utilizendu u pacchettu MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) suggerenu pussibuli cunfurmazioni chì differenu trà sti proteini (Fig. 8A).A visualizazione di u cumplessu di a proteina di docking hà revelatu parechje interazzione è cunformazioni pussibuli (Figura 5A, 8).Cusì, una cunformazione pussibule hè mostrata in a Figura 8A (cù ligami incruciati marcati) è hè stata evaluata ulteriormente utilizendu a pipeline di modellazione MD.Inoltre, u ligame di H2B o HMGA1 à HLA-A mette in risaltu a più alta affinità di H2B per HLA-A (Fig. 8A).
Dinamica conformazionale di e pussibuli rete trà i complexi H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A è H2B-HLA-A-HMGA1.(A) U pannellu di manca hè una mappa 2D (generata in u software SIM-XL) di ligami intramoleculari (rossi) è intermoleculari (blu) (cutoff crosslink impostatu à 3.5).Inoltre, i residui di cross-linking identificati sò marcati nantu à e strutture di e proteine ​​​​H2B, HLA-A è HMGA1.I cunfurmazioni assuciati di sti proteini sò stati estratti utilizendu a pipeline di docking implementata in u pacchettu MOE.U pannellu in basso à manca mostra e diverse cunfurmazioni pussibuli di i complexi H2B-HLA-A è HMGA1-HLA-A cù diverse affinità di legame proteina-proteina (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Deviazione standard (RMSD) di pusizioni atomiche (senza l'atomi di l'idrogenu) per ogni struttura di prutezione.(C) Intermolecular proteina-proteina interazzione di ligame di l'idrogenu da diversi cumplessi simulati cunsiderendu interazzioni specifichi di durata ≥ 10 ns.A distanza di cutoff donatore-accettore h-bond hè stata stabilita à 3.5 Å, è l'angolo di cutoff donatore-H-accettore hè stata stabilita à ≥ 160 °-180 °.(D) Residui marcati chì formanu interazioni proteina-proteina HLA-A cù i so rispettivi partenarii, spanning ≥ 20 ns, estratti da complessi HLA-A-H2B e HLA-A-HMGA1 fittizi.Strutture di proteina rapprisentanu una struttura media di 100 ns MDS.(E) Interazioni trà i cumplessi HLA-A-H2B è HLA-A-HMGA1 paragunatu à l'interazzione tracciate da a simulazione H2B-HLA più di 100 ns basatu annantu à u situ di interazione K o S trà i dui peptidi.Complexes /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.U valore di limitu per a valutazione di i ligami incruciati hè statu stabilitu à 3.0, è l'interazzione specifiche da MDS chì piglianu ≥ 10 ns sò stati cunsiderati.E strutture di a proteina sò state visualizate cù i pacchetti BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) è Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).
A stabilità di e molécule HLA-A in u tempu (deviazione standard; RMSD o deviazione standard; RMSF) hà indicatu chì a presenza di proteine ​​​​H2B o HMGA1 in i cumplessi stabilizzò HLA-A (Figura 8B, Figura S5).A proteina HMGA1 si lega strettamente à u situ B2M di HLA-A, inducendu a stabilità di l'aminoacidi HLA-A in u complexu HLA-A-HMGA1 o H2B-HLA-A-HMGA1 (Figura 8B, Figura S5).in particulare, i residui HLA ~ 60-90 è ~ 180-210 sò stati trovati menu flexible in presenza di H2B (FIG. 8B).H2B è HMGA1 anu dimustratu un ligame megliu à HLA-A in u cumplessu H2B-HLA-A-HMGA1 paragunatu à u ligame HLA-A à H2B o HMGA1 solu (Figura 8C, D; Table S5).I residui implicati in u ligame di l'idrogenu (MD modelled high occupancy ≥ 10 ns) coincidenu cù i siti d'interazzione CLMS (residui K o S) in u cumplessu, chì suggerenu chì l'interazzione identificate da CLMS sò assai affidabili.Reliability (Fig. 8E).In u mudellu CLMS è MD, i residui HLA-A trà circa 190-210 è circa 200-220 aminòciti sò stati trovati à ligà H2B è HMGA1, rispettivamente (FIG. 8E).
L'interazzione proteina-proteina formanu rete strutturale dinamica chì medianu a cumunicazione intracellulare in risposta à certi stimuli.Perchè parechji approcci di proteomica rilevanu cambiamenti in u livellu generale di u statu di una proteina, a dinamica di l'interazzione proteina-proteina richiede strumenti supplementari per catturà interfacce di legame, è CLMS hè un tali strumentu.U sistema di signalazione di l'interferonu hè una rete di citochine chì permette à e cellule di risponde à una serie di signali patogeni patogeni è intrinseci di l'ambiente, culminendu in l'induzione di sottogruppi di proteine ​​​​inducibili da interferone.Avemu applicatu CLMS per determinà se l'interazzione nova proteina-proteina puderia esse identificata trà un pannellu di proteine ​​​​indutte da interferone.L'analisi di cross-linking di proteine ​​​​globale in un mudellu di cellula Flo-1 responsive à l'interferonu hè stata utilizata per catturà complexi di proteina.L'estrazione di peptidi triptichi da e cellule non cross-linked è cross-linked permette di cuntà peptide, arricchimentu di via, è distribuzione di lunghezza di peptide cù intensità LFQ definita.E proteine ​​​​inducibili da l'interferonu canonicu sò state identificate cum'è un cuntrollu internu pusitivu, mentre chì novi adducts intermoleculari è intramoleculari cross-linked di proteine ​​​​inducibili da l'interferonu canonicu cum'è MX1, UP18, OAS3 è STAT1 sò stati osservati.Diverse caratteristiche strutturali è interazzione in i spazii funziunali sò stati investigati.
Una interazione trà HLA-A, MDN1 è H2B hè stata rilevata da immunoblotting in cellule Flo-1 è A549 trattate è micca trattate cù IFNα.Nos résultats mettent en évidence que les complexes HLA-A et H2B dépendent de l'IFNα.U nostru travagliu rapprisenta una strada interessante per più esplorazione di a co-localizazione di sti dui cumplessi.Saria ancu interessante di espansione l'approcciu CLMS à un pannellu di linee cellulari per identificà interazzione di proteina mediata da interferone indipendente da u tipu di cellula.Infine, avemu usatu a modellazione MD cum'è un approcciu alternativu per capisce a dinamica conformazionale di e proteine ​​​​implicate in u cumplessu H2BFS-HLA-A-HMGA1, chì seguitava i dialoghi intramoleculari è intermoleculari.Inferenzi da i dati CLMS suggerenu a pussibilità di diverse cunfurmazioni di e proteine ​​​​H2BFS, HLA-A è HMGA1.E pussibuli cunformazioni diverse trà questi cumplessi di proteine ​​​​di docking anu revelatu parechje interazzioni simili à quelli osservati in u set di dati CLMS.Unu di i punti di forza principali di u nostru metudu hè chì permette l'identificazione faciule di genesi altamente polimorfi chì interagiscenu cum'è HLA, cusì serà interessante per studià l'interazzione di e proteine ​​​​specifiche di l'aplotipu HLA chì altrimenti sò difficiuli di studià.Inseme, i nostri dati dimustranu chì CLMS pò esse aduprata per espansione a nostra cunniscenza di e rete di signalazione indotta da interferoni è furnisce una basa per studià sistemi intercellulari più cumplessi in u microambientu tumorale.
E cellule Flo-1 sò state ottenute da ATCC è mantenute in DMEM (Gibco) supplementate cù 1% di penicillina / streptomicina (Invitrogen), 10% di siru bovinu fetale (Gibco) è conservate à 37 ° C è 5% CO2.Incubazione.E cellule sò cultivate à 70-80% di cunfluenza prima di esse trattate cù IFNα14 (fabbricatu da Edinburgh Protein Production Facility).Tutti l'altri chimichi è reagenti sò stati acquistati da Sigma Aldrich, salvu chì altrimenti nutatu.
E cellule Flo-1 sò state cultivate in piastre di 6 pozzetti è u ghjornu dopu, e cellule sò state trattate cù 10 ng/ml IFNα14 per 24 ore à circa 80% di cunfluenza.I celluli sò lavati trè volte cù PBS è ligati cù DSS (Thermo Fisher Scientific) appena preparatu (dissoltu in DMSO) in PBS per 5 min à 37 ° C. à una cuncentrazione finale di 0,5 mM.A reazione di reticulazione DSS hè stata rimpiazzata cù PBS è u DSS residuale hè statu spentu aghjunghjendu 20 mM Tris (pH 8,0) in PBS per 15 min à 37 ° C.E cellule sò state raccolte da scraping è cullate in tubi di ligame bassu (Axygen).
La pellet cellulare è stata lisata con 300 µl di tampone di lisi di urea (urea 8 M, Tris 0,1 M, pH 8,5) per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione occasionale.Tutti i passi di centrifugazione sò stati realizati à 14.000 xg à 8 ° C.Centrifuga u lisatu per 10 minuti è trasfiriu u supernatant à un novu tubu.I particeddi chjaru rimanenti sò stati dissolti in 150 μl di a seconda buffer di lisi (2 M urea, 2% (w / v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) per 30 minuti o più finu à chì una soluzione aquosa omogenea hè stata ottenuta.U lisatu hè stata centrifugata per 20 minuti è u supernatant hè mischju cù u lisatu ottenutu in u passu precedente.A cuncentrazione di proteina hè stata valutata cù l'assay Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) secondu l'istruzzioni di u fabricatore per e prucedure di microplate.I campioni sò stati congelati rapidamente in nitrogenu liquidu è almacenati à -80 ° C.
Circa 100 μg di proteina reticulata soluble sò stati processati cù un protocolu di preparazione di mostra di filtrazione modificata (FASP) cum'è deskrittu da Wisniewski et al.69 In breve, la proteina è reticolata con 200 µl di tampone urea (urea 8 M in Tris 0,1 M, pH 8,5), vortexata e dimezzata.Tutti i passi di centrifugazione sò stati realizati à 14.000 xg à 25 ° C.A prima mità di u lisatu di proteine ​​​​cross-linked hè stata trasferita à un filtru centrifugu Microcon 10 kDa equipatu cù una membrana Ultracel-10 (Merck), seguita da centrifugazione nantu à u filtru per 25 minuti.Allora aghjunghje a seconda mità di a proteina à u filtru è repite i stessi passi.Il recupero delle proteine ​​è stato effettuato aggiungendo 100 μl di tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP) 17 mM in tampone di urea.A ricuperazione hè stata agitata nantu à un thermomixer à 600 rpm per 30 min à 37 ° C.Inoltre, a colonna hè stata centrifugata è a proteina reticulata ridotta hè stata alchilata cù 100 μl di iodoacetamide 50 mM in tampone di urea.A reazione di alchilazione hè stata fatta à a temperatura di l'ambienti per 20 minuti in u bughju.Girate a colonna, lavate e pareti di a colonna 3 volte cù 100 µl di tampone di urea, è poi centrifuga.A stessa operazione hè stata fatta 3 volte cù 100 μl di bicarbonate d'ammoniu 100 mM.Prima di tripsinizazione, rimpiazzà u tubu di cullizzioni cù un novu.Aggiungere un tampone di digestione contenente 50 mM di bicarbonato di ammonio e 1 µl di tripsina diluita in tampone di tripsina (Promega).U rapportu di tripsina à a proteina hè stata mantinuta à circa 1: 33, è e riazzioni di digestioni sò incubati per a notte à 37 ° C. in una camara umida.U peptide reticulatu hè statu eluutu da u filtru per centrifugazione per 25 minuti.A ricuperazione di peptidi hè stata migliurata aghjunghjendu 50 μl di 0,5 M NaCl à u filtru, seguitu da centrifugazione per 25 minuti.
I culonni C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) sò stati utilizati per desaltà i peptidi tryptic cross-linked in seguitu à u protocolu descrittu da Bouchal et al.70 cù mudificazioni minori.In breve, e colonne di spin C18 sò attivate cù trè lavaggi di 0.1% àcitu formicu (FA) in acetonitrile (AcN) (Merck) è dui lavaggi di 0.1% FA.A colonna hè stata idratata cù 0.1% FA per 15 minuti.Caricà i campioni in colonne di spin è lavate 3 volte cù 0,1% FA.I peptidi dessalati sò stati eluiti sequenzialmente cù un gradiente stepwise usendu 50%, 80% è 100% AcN in 0,1% FA.I campioni sò stati secchi in un concentratore SpeedVac Plus (Eppendorf) finu à chì u liquidu residuale hè sparitu cumplettamente.I peptidi elutati sò stati dissolti in 100 μl di 0,08% d'acidu trifluoroacetic in 2,5% AcN è e cuncentrazioni sò misurate nantu à un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Circa 1 μg di peptide reticulatu per mostra hè stata iniettata in u sistema LC-MS / MS.
I peptidi cross-linked sò stati separati nantu à un sistema UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) cunnessu à un spettrometru di massa Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).I peptidi reticulati sò stati raccolti nantu à una colonna di cattura C18 µ-pre-colonna C18 di 300 µm ID, lunga 5 mm imballata cù sorbente C18 PepMap100 è 5 µm sorbent PepMap (Thermo Scientific).Caricà u flussu di pompa stabilitu à 5 µl/min 0,08% d'acidu trifluoroaceticu dissolutu in 2,5% AcN.I peptidi reticulati sò stati separati nantu à una colonna di silice fusa analitica cù un diametru internu di 75 μm è una lunghezza di 150 mm, pienu di un sorbente PepMap 2 μm (Thermo Scientific).E fasi mobili A è B consistanu di 0,1% FA in acqua è 0,1% FA in acetonitrile, rispettivamente.U gradiente principia da 2,5% B è aumenta linearmente à 40% B in 90 minuti, dopu à 90% B in i prossimi 2 minuti.A cumpusizioni di a fase mobile hè stata mantinuta à 90% B per 10 minuti è poi diminuite linearmente à 2.5% B in 2 minuti.A colonna hè stata equilibrata à 2,5% B per 8 minuti prima di u prossimu ciclu.I peptidi cross-linked eluiti da a colonna analitica sò stati ionizzati in una fonte di ionizzazione nanoelectrospray (NSI) è injected in un spettrometru di massa Exploris 480 (Thermo Scientific).
U spettrometru di massa Orbitrap Exploris 480 hà operatu in u modu di correlazione di dati pusitivi.Una scansione completa hè stata realizata in modu di sezione à una risoluzione di 120.000 cù paràmetri di gamma da m/z 350 Th à m/z 2000 Th.U target AGC normalizatu hè statu stabilitu à 300% cù un tempu massimu di input di 50ms.A rilevazione di picchi monoisotopichi hè stata stabilita per i peptidi.U paràmetru di rilassazione di restrizzioni hè stabilitu à veru se si trovanu troppu pochi precursori.A forza ionica minima di u precursore hè stata stabilita à 5.0e3 è stati di carica di precursore finu à + 8 sò stati inclusi in l'esperimenti.
U tempu di ciclu trà e scansioni maiò in u modu di correlazione di dati hè stata stabilita à 2,5 seconde.L'esclusione di massa dinamica hè stata stabilita à 20 s dopu a prima frammentazione di l'ione precursore.A finestra di isolamentu di i precursori hè stata stabilita à 2 Th.U tipu d'energia di collisione nurmalizata cù un modu di energia di collisione fissa hè stata scelta in una scansione MS / MS dipendente di dati.L'energia di collisione hà stabilitu à 30%.A risoluzione Orbitrap hè stata stabilita à 15,000 è u target AGC à 100%.U tempu d'iniezione massimu persunalizatu hè stabilitu à 60 millisecondi.
Prima di seguità a reta di proteina-proteina in campioni cross-linked, avemu processatu i schedarii crudi cù u pacchettu MaxQuant (versione 1.6.12.0)26,27 per identificà peptidi / proteini tracciabili in i campioni.Inoltre, analisi proteomiche simili sò state realizate nantu à campioni Flo-1 uncrosslinked trattati è micca trattati cù IFNα.I dati MS / MS sò stati cercati in a basa di dati umana UniProt (www.uniprot.org) (caricata u 12 d'Agostu 2020, cuntene 75,093 voci) utilizendu u mutore di ricerca integratu Andromeda27.A ricerca hè stata fatta senza indicà a specificità di l'enzyme è diverse mudificazioni di deamidation (N, Q) è oxidazione (M).E tolleranze di massa di precursori sò state stabilite à 20 ppm è ioni di produttu à 0,02 Da.A deviazione di massa iniziale è massima hè stata stabilita à 10 ppm.A massa massima di u peptide hè stata stabilita à 4600 Da è a sequenza di similarità hè stata stabilita trà 7 è 25 aminoacidi (aa).Ulteriore analisi statistiche hè stata realizata cù u prugramma Perseus (versione 1.6.10.45).U cuntenutu di prutezione hè statu calculatu normalizendu l'intensità spettrale di a proteina (intensità LFQ; quantificazione senza etichetta)27 è i valori di intensità sò stati cunvertiti in Log2.Un clustering gerarchicu di proteine ​​​​identificate da a so intensità di peptide hè statu custruitu cù u pacchettu pheatmap (v1.0.12) in R (v 4.1.2).L'analisi di arricchimentu di a via hè stata realizata utilizendu a basa di dati di a via Reactome per e proteine ​​​​trattate cù IFNα chì eranu più di quattru volte attivate in paragunà à i campioni micca trattati.
L'identificazione di lisine (K) o serina (S) specifichi di reticulazione chimica di cumplessi di proteina monitorati da LC-MS / MS hè stata realizata utilizendu una macchina d'identificazione spettroscopica (SIM-XL) per peptidi cross-linked (SIM-XL)29.Prima, i pussibuli interazzione trà l'interferon-associated (IFN) DNA signatura di resistenza di dannu (IRDS) genes sò stati investigati cù u dataset di a proteina IRDS descritta in Padariya et al.28.U screening di tutte e cundizioni è ripetizioni di l'UniProt umanu tutale hè intensivu in computazione, cusì tutta a basa di dati UniProt umana (www.uniprot.org) (scaricata u 12 d'Agostu 2020, cuntene 75,093 voci) contr'à e ripetizioni trattate cù IFNα.Unu di i filtri per interazzione di alta fiducia.Queste interazzione di altu significatu ottenuti sò stati allargati è pruvati in tutte e repetizioni è cundizioni.
In SIM-XL, DSS hè stata utilizata per u crosslinker (XL) è u cambiamentu di pesu XL è u cambiamentu di pesu di mudificazione sò stati 138.06 è 156.07, rispettivamente.I seguenti siti di reazzione crosslinking sò cunsiderati: KK, KS è KN-TERM, senza ioni reporter.Sia u precursore è u fragmentu ppm sò stati stabiliti à 20 è u sogliu Xrea hè statu stabilitu à 0,15.A tripsina hè stata cunsiderata cum'è cumpletamente specifica, è un metudu di frammentazione C-trap (HCD) d'alta energia hè statu implementatu.U limitu di riduzzione dinamica di DB XCorr è u numeru minimu di peptidi per a riduzzione dinamica di DB sò stati stabiliti à 2,5 è 2, rispettivamente.L'altri parametri sò: probabilità di monoisotopi è cutoff di u piccu di coincidenza, minimu 4 residui AA per filu è carica massima di filu, è 3 massimi di split mancati.I mape 2D cuciti risultanti sò stati analizati in (SIM-XL) è a rapprisentazione gràfica xQuest28 hè stata aduprata per custruisce e carte 2D.I crosslinks di proteine ​​​​in strutture di proteina sò furniti in PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versione 2.0 Schrödinger, LLC).
Strutture di mudelli di proteini sò stati creati utilizendu u servitore Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 utilizendu i principii di a modellazione di l'omologia è l'implementazione di u "Metudu Markov Hidden".Phyre2 genera strutture mudelli basate nantu à l'allineamentu di sequenza cù strutture di proteina cunnisciute.Per e proteine ​​​​H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 è MDN1, sò stati usati strutture di mudelli 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 è 6i2665.Inoltre, a struttura di AlphaFold71 MX1, UBP18 è ROBO1 hè statu ancu cunsideratu.A struttura di a proteina hè stata visualizata cù u pacchettu BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) è u pacchettu Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).