310 10 * 1mm Componente chimicu di tubi spiralati in acciaio inossidabile, I domini N-terminali di spidroin formanu idrogeli basati in fibrille amiloidi è furnisce una piattaforma per l'immobilizazione di e proteine.

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Specificazione

310 10 * 1mm Fornitori di tubi spiralati in acciaio inox

Cumpusizioni chimica

Pruprietà meccanica

I proteini di sita di spider recombinant (proteini di sita di spider) anu parechje applicazioni potenziali in u sviluppu di novi biomateriali, ma a so natura multimodale è propensu à l'aggregazione li rende difficili d'ottene è faciule d'utilizà.Quì raportemu chì e proteine ​​​​di spidroin miniatura ricombinanti è, più impurtante, u duminiu N-terminale (NT) stessu formanu rapidamente idrogeli autoportanti è trasparenti à 37 ° C.e proteine ​​di fusione costituite da NT è proteina fluorescente verde o purina nucleosidica fosforilasi formanu proteine ​​​​di fusione cumpletamente funzionali.Idrogeli.I nostri risultati mostranu chì e proteine ​​​​di fusione è NT recombinanti furniscenu rendimenti elevati di espressione è dotanu l'idrogeli di proprietà attraenti cum'è a trasparenza, a gelazione senza reticulazione è l'immobilizazione diretta di proteine ​​​​attive à alta densità.
L'armi anu finu à sette setti diffirenti di glànduli di sita, ognuna chì pruduce un tipu specificu di seta.Tutte e sette spezie di seta sò cumposti da proteine ​​​​di seta di spider (spidroins) circa 6000 residui longu è cuntenenu una grande regione di ripetizione centrale circundata da domini sferici N- è C-terminali (NT è CT)1,2.U tipu di sita più studiatu, l'ampulla primaria, hè prodotta da a glàndula ampulla primaria.In questa glandula, un monolayer di cellule epiteliali sintetizza e proteine ​​​​di spidroin è li secrete in u lumen di a glandula, induve sò prisenti in una forma solubile (doping) à cuncentrazioni estremamente elevate (30-50% w / v) 3,4.L'urganizazione è a cunfurmazione di e proteine ​​​​ampullar spidroin principali in a glàndula hè stata dibattuta, ma a maiò parte di l'evidenza sperimentale indica a prisenza di una conformazione elicoidale generale è / o aleatoria è strutture micellari o lamellari5,6,7,8,9,10.Mentre i duminii ripetitivi regulanu e proprietà meccaniche di fibre di seta, furmendu nanocristalli β-sheet è strutture amorfi11,12,13,14,15, i duminii finali regulanu e fibre di seta in risposta à e cundizioni cambianti longu a glandula di seta16,17,18.Per cuntrullà a furmazione di sita, 19. I duminii terminali sò cunservati evolutivamente è a so funzione pò esse cumuna à tutte e proteini spidroin 2,20,21.Durante u passaghju per a glandula, u pH di spidroin diminuite da circa 7,6 à < 5,716 è aumenta cù u cisura è l'allungamentu mediatu da u muvimentu à traversu u duct chì si restringe gradualmente.En solution, le CT est un dimère parallèle constitutif α-hélicoïdal17, mais en réponse à un pH bas et à des forces de cisaillement, le CT se déploie et change les couches β16, 17, pouvant déclencher des couches β dans les régions répétitives de Convert 16. Les NT sont monomériques sous cundizzioni chì riflettenu e cundizioni in u lumen di a glandula è mediate a solubilità di spidroin, ma à un pH ridutta, a protonazione di una quantità di catene laterali di l'acidu carboxylic porta à a dimerizazione di NT cù un pKa di circa 6,5, stabilizà cusì NT è fissa spidroin in grande. quantità.rete16,18.Cusì, NT ghjoca un rolu chjave in a furmazione di filamenti, cambiendu da un monomeru in u revestimentu à un dimeru in a fibra23,24,25.NT ferma assai solubile è elicoidale in tutte e cundizioni studiate finu à a data16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, chì hà inspiratu u so sviluppu cum'è una etichetta chì aumenta a solubilità per a produzzione di proteini eterologi.
A proteina di seta di mini spider ricombinante, composta da una NT, una regione di ripetizione corta, una CT, è un tag His6 (His-NT2RepCT) per a purificazione, hè solu solubile in buffer acquoso cum'è a proteina di seta di ragna nativa è imita e caratteristiche impurtanti native di a ragna di seta. .copertura 25.31.His-NT2RepCT pò esse filatu in fibri cuntinui cù una macchina biomimetica in quale un revestimentu solubile di pH 8 hè estrusu in un bagnu d'acqua di pH 525,32,33,34,35.A fermentazione di u bioreattore di E. coli chì esprimenu His-NT2RepCT è u post-trattamentu sussegwenti hà risultatu in > 14 g / L di rendiment dopu a purificazione.L'altu rendiment, l'alta solubilità è a risposta adatta di His-NT2RepCT à e cundizioni acide sò tutti attribuiti à NT23, 25, 34.
Qui riportemu a furmazione rapida di idrogeli trasparenti da proteine ​​​​di spidroin ricombinanti, cumprese NT solu, incubando una soluzione di proteina à 37 ° C.Utilizendu a fluorescenza di tioflavina T (ThT), a spettroscopia infrarossa di trasformazione di Fourier (FTIR), a spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è a microscopia elettronica di trasmissione (TEM), avemu truvatu chì e proteine ​​​​NT è microspider subenu trasfurmazioni strutturali in β-sheets è fibrille amiloide. quandu i geli sò furmati.Inoltre, proteine ​​​​di fusione di NT è proteina fluorescente verde (GFP) o purine nucleoside fosforilasi (PNP) formanu idrogeli cù frammenti di fusione cumplettamente funzionali.L'espressione high-throughput in ospiti eterologi, accumpagnata da a furmazione rapida di l'idrogeli in cundizioni fisiologiche, apre a pussibilità di una produzzione rentabile di idrogels cù funzioni ingegneria.
A cuntrariu di a maiò parte di e proteine ​​​​di spidroin ricombinanti riportate36, His-NT2RepCT hè stabile in buffer Tris-HCl à pH 8 è pò esse cuncentrata finu à 500 mg/mL senza precipitazione25.Per quessa, eramu sorpresu di truvà chì sta proteina forma rapidamente idrogeli otticu chjaru, autosuportante quandu incubate à 37 ° C (Fig. 1b-d).Ulteriori studii anu dimustratu chì a gelazione His-NT2RepCT hè accadutu nantu à una larga gamma di cuncentrazione di prutezione (10-300 mg / mL) è chì sta cuncentrazione era inversamente correlata cù u tempu di gelazione (Fig. 1c è Supplementary Fig. 1).Per sapè quale parte di His-NT2RepCT mediate a furmazione di l'idrogelu, avemu allora esaminatu ogni duminiu individualmente è in diverse cumminazioni utilizendu un test d'inversione di flask (Figura 1a, b).Tutte e frazzioni pruvati di spidroin recombinante formanu gels (à una cuncentrazione di prutezione di 300 mg / mL) in menu di 1 h, salvu 2Rep precipitatu (Fig. 1b).Questu suggerisce chì NT è CT solu, in cumbinazione, o assuciati cù ripetizioni, ponu gelà à 37 ° C è chì l'etichetta His6 ùn affetta micca stu prucessu in una misura significativa.Data a nozione cumuna chì NT hè una proteina altamente solubile è stabile, è chì i rapporti precedenti di l'idrogeli di spidroin recombinante anu attribuitu effetti di gelazione à i cambiamenti conformazionali in regioni ripetute è / o CT, NT stessu puderia.A scuperta di gelazione hè stata inespettata.Supplementary Table 1) 37, 38, 39. Notevolmente, NT hà digià gelled in 10 minuti à una cuncentrazione di ≥ 300 mg / mL (Fig. 1c).Esperimenti d'inversione di vial cù diverse concentrazioni di NT dimustranu chì à> 50 mg / mL a suluzione NT geled più veloce di His-NT2RepCT à a cuncentrazione currispundente (w / v, Figura 1c).
Rappresentazione schematica di vari custruzzioni di spidroin studiati in stu travagliu.b Tempu di gel à 37 °C per diverse proteine ​​​​di spidroina ricombinanti (300 mg/mL) verificatu invirtendu a fiala.Gel CT immediatamente senza incubazione (<300 mg/mL), precipitate 2Rep (300 mg/mL, scala 5 mm).c Tempu di gel di His-NT2RepCT è NT à a cuncentrazione di prutezione indicata à 37 ° C.d Fotografie di l'idrogeli His-NT2RepCT è NT cù a spider è a lettera "NT" stampata sottu, rispettivamente (i dui 200 mg/mL, scale bar 5 mm).
L'idrogeli furmati da parechji proteini di spidroin recombinante anu culori ligeramente diffirenti, è l'osservazione di l'occhiu nudu mostra diversi gradi di trasparenza (Fig. 1b).I geli NT sò eccezziunale chjaru mentre chì altri geli diventanu opachi.His-NT2RepCT è NT gels cast in tubi cilindrichi puderanu esse eliminati da u moldu intactu (Fig. 1d).
Per pruvà se i rivestimenti naturali di seta di spider gel in e cundizioni chì si trovanu avà per pruvucà a gelazione di e proteine ​​​​di spidroin recombinant, i rivestimenti sò stati raccolti da a grande glàndula ampulla di u spider ponte svedese (Larinioides sclopetarius).I rivestimenti sò stati almacenati in 20 mM Tris-HCl buffer à 50 mg / mL (basatu nantu à u pesu seccu misuratu), ma ùn hè stata osservata alcuna gelificazione durante l'incubazione di 21 ghjorni à 37 ° C (Figura supplementaria 2a).
Per quantificà questi geli, e misurazioni reologiche ponu esse aduprate per studià u prucessu di gelazione è determinà e proprietà meccaniche generale.In particulare, u monitoraghju di u modulu di almacenamiento (elasticità) à temperature elevate pò furnisce infurmazioni nantu à a temperatura di gelificazione è e proprietà viscoelastiche di u revestimentu.Esperimenti d'aumentu di a temperatura (utilizandu 1 ° C / min à 25-45 ° C, basatu annantu à studii precedenti chì utilizanu solu suluzione di seta naturali) 40,41 hà dimustratu chì i moduli di almacenamento di e soluzioni His-NT2RepCT è NT aumentanu cù a temperatura crescente.hè statu aumentatu (Fig. 2 è Supplementary Fig. 3).In particulare, u modulu NT hà cuminciatu à cresce à una temperatura più bassa paragunata à His-NT2RepCT, in cunfurmità cù u tempu di gel più veloce osservatu quandu NT hè stata incubata direttamente cù His-NT2RepCT à 37 ° C (Figura 1).Dopu una caduta di a temperatura successiva, u modulu di almacenamentu ùn hà micca tornatu à i valori più bassi è si ferma sopra à u modulu di perdita (vede Supplementary Fig. 3), chì indica una gelazione stabile irreversibile termale.Dopu a gelificazione, u modulu elasticu finale variava da 15 à 330 kPa per l'idrogeli His-NT2RepCT à una cuncentrazione di 100-500 mg/mL, è u modulu elasticu finale per l'idrogeli NT (100-500 mg/mL) variava da 2 à 1400. kPa (Fig. , 2 è dati di rampa cumpleta) vede Supplementary Fig. 3).
a Variazione di temperatura durante e misurazioni di His-NT2RepCT (300 mg/mL) è b NT (300 mg/mL) cù agitazione.E frecce indicanu a tendenza di a temperatura, è l'ombra più ligera di i dati di u modulu di almacenamento mostra a prova à valori di torque più bassi per l'instrumentu di quelli specificati da u fabricatore, chì hè a causa di u rumore aumentatu.c Accumulazione di u modulu finale di His-NT2RepCT è NT dopu a temperatura elevata (100, 300 è 500 mg/mL).Tutte e letture di u modulu sò pigliate à una frequenza di 0.1 Hz.
Cum'è un metudu potenziale per investigà i cambiamenti conformazionali assuciati à a gelazione, avemu registratu spettri FTIR di His-NT2RepCT è NT prima è dopu a gelazione à 37 ° C (Figura 3a, b).Cum'è previstu, i spettri di e soluzioni His-NT2RepCT è NT currispondenu à e proteine ​​​​che mostranu una struttura secondaria di α-helix/coil random, cù una banda pronunciata à 1645 cm-1.Per i dui hydrogels, a gelazione hà risultatu in a furmazione di dui braccia in a banda I media à circa 1617 cm-1 è 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), chì indicanu a furmazione di strutture antiparalleli β-sheet.Questi cambiamenti ponu ancu esse chjaramente vistu in i spettri di gelazione di a seconda derivata è a differenza (Figura supplementaria 4b).E duie bande di u NT β-layer eranu più pronunzianu di quelli di His-NT2RepCT, chì indicanu chì u cuntenutu tutale di bande β-layer in l'idrogelu NT era più altu ch'è quellu di l'idrogelu NT2RepCT.
a spettri di assorbimentu FTIR di His-NT2RepCT è b NT (sia 500 mg/mL) prima (soluzione) è dopu (gel) incubazione à 37 ° C.c images TEM di gel NT2RepCT 50 mg/ml risospesi e d NT.Scala bar 200 nm.e Diametri di fibre di His-NT2RepCT è NT hydrogels.n = 100 fibrille misurate, p < 0,0001.E barre d'errore mostranu a deviazione standard.U centru di e barre d'errore hè u mediu.Per l'analisi statistiche hè stata utilizata una prova di t unpaired (due coda).f Fluorescenza ThT di varie proteine ​​​​di spidroina ricombinanti (100 mg/mL) a 37 ° C senza agitazione.g NT (100 mg/mL) esperimenti di inoculazione da 100 mg/mL NT gel cù 0%, 5%, 10% è 20% di sementi.
L'analisi di u gelu cù a microscopia elettronica di trasmissione (TEM) hà dimustratu chì l'idrogel hè custituitu da fibrilli amiloidi (Figs. 3c, 3d).I fibri NT-formati eranu allungati (5-12 nm di diametru) è unbranched, mentri His-NT2RepCT fibrilli eranu più brevi in ​​longu è significativamente più largu di diametru (7-16 nm) (Fig. 3e).Questi risultati ci anu permessu di seguità a cinetica di fibrosi cù l'assay di thioflavin T (ThT).Per tutte e proteine ​​​​di spidroin recombinante, u signale fluoriscente aumentatu quandu i mostri sò stati incubati à 37 ° C (Fig. 3f, Supplementary Fig. 5a).In cunfurmità cù questa scuperta, l'esame microscòpicu di NT è His-NT2RepCT in cundizioni di gelling hà revelatu un incrementu uniforme di a fluorescenza ThT senza accumulazione locale notevole di aggregati ThT-positivi (Figura supplementaria 5b, c).A furmazione di fibrille ThT-positivi ùn era micca accumpagnata da un incrementu di NT è His-NTCT turbidity (Figura Supplementaria 5d), chì significa chì una reta di fibrilli in u gelu puderia formate senza compromette a clarità di gel.A semina aghjunghjendu picculi quantità di fibrille preformate pò accelerà significativamente a furmazione di fibrilla di certi amiloidi42,43,44 ma aghjunghjendu 5%, 10% o 20% (w/w) NT à una suluzione di NT hydrocoagulants.effettu seeding (Fig. 3g).Forsi questu hè duvuta à u fattu chì i fibrilli in l'idrogelu sò relativamente fissi è ùn ponu micca esse usatu cum'è sementi.
U cumpurtamentu inespettatu di e proteine ​​​​spidroin recombinant à alte temperature hà incitatu più studii di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) per identificà cambiamenti conformazionali assuciati à a furmazione di gel.I spettri RMN di suluzioni His-NT2RepCT registrati cù u tempu à 37 ° C anu dimustratu chì CT era ancu parzialmente plegata, mentre chì i segnali NT è 2Rep eranu spariti (Fig. 4a), suggerendu chì era principalmente NT è 2Rep chì a furmazione parzialmente cuntrullata di His- NT2RepCT idrogelu.U signale CT hè statu ancu attenuatu à u 20% di a so intensità originale, chì suggerenu chì CT hè ancu soprattuttu fissatu è incorporatu in a struttura di l'idrogel.Per una parte più chjuca di u CT, chì hè mobile cum'è in a mostra preincubata è cusì osservata da a suluzione NMR, i spettri ùn mancanu signali per i primi 10 residui strutturati, possibbilmente per via di l'immobilizazione difficiule di a parte attaccata di His-NT2Rep.I spettri NMR di u -state of hydrogels -NT2RepCT palesanu a presenza predominante di α-helices è β-layers è, in una misura minima, a conformazione di bobina aleatoria (Fig. 4b).L'analisi di shift chimicu di i residui di methionine prisenti solu in NT hà dimustratu chì stu duminiu hè statu cunvertitu in una struttura β-sheet.U spettru dipendente di u tempu di NT in suluzione dimustrava una diminuzione uniforme di l'intensità di u signale (Fig. 4c), è a RMN di u statu solidu di l'idrogeli NT hà dimustratu chì a maiò parte di i residui NT sò cunvertiti in strutture β-sheet (Fig. 4d).A conformazione di 2Rep ùn pò micca esse determinata separatamente per a so tendenza à aggregate.In ogni casu, i spettri RMN di u statu solidu di l'idrogeli NTCT è His-NT2RepCT parevanu assai simili (Fig. 4b; Supplementary Fig. 6b), suggerenu chì 2Rep hà cuntribuitu pocu à a parte strutturale di l'idrogel His-NT2RepCT.Per l'idrogeli CT, α-helices, β-sheets, è strutturi secundarii helical aleatoriu sò stati trovati (Figura supplementaria 6d).Ceci suggère que certaines parties du CT restent des hélices α tandis que d'autres deviennent des feuilles β.Cusì, i risultati di a spettroscopia RMN suggerenu chì NT hè impurtante per a furmazione di l'idrogelu è ancu trasforma in una conformazione di foglia β dopu a fusione cù 2Rep è CT.In cunfurmità cù questu, avemu trovu pocu tempu chì i zippers spaziali amiloidi prubabilmente formanu in tutti i cinqui helices di u duminiu NT, è l'algoritmu di Waltz predice una regione amiloidogena in l'helix 1 (Fig. 4e).
Spettri 2D di 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT suluzione prima (blu) è 19 ore dopu incubazione (rossu) à 37 ° C.I picchi incruciati individuali in u spettru rossu è F24, G136, polyA in u spettru blu sò denotati da simboli d'aminoacidu di una sola lettera è numeri di residui.L'inseriti mostranu a dependenza di l'intensità di u segnu à u tempu per i residui selezziunati da i domini NT, 2Rep è CT.b Spettri di radiofrequenza à u statu solidu (RFDR) di l'idrogeli His-NT2RepCT.Les corrélations des résidus Cα/Cβ observés dans les spectres RFDR ont été déterminées par comparaison avec les changements chimiques du peptide modèle et les valeurs dérivées des statistiques82,83 et de leurs structures secondaires.SSB - banda laterale rotante.c Spettri unidimensionali di soluzione 15N-HSQC 10 mg/mL NT durante l'incubazione à 37 °C per 36 ore.L'inseritu mostra l'intensità volumetrica versus u tempu.d Spettri RFDR à u statu solidu di idrogeli NT.Les corrélations des résidus Cα/Cβ et leurs structures secondaires observées dans les spectres RFDR sont indiquées.e Basatu nantu à u prufilu di propensione di fibrillazione NT45.79 da a basa di dati Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).L'energia Rosetta di a finestra di spostamentu di u lampu spaziale di l'hexapeptide hè mostrata in kcal / mol.Red bars denote hexapeptides cù una alta propensione fibrosis (energia Rosetta sottu -23 kcal / mol; sottu à a linea punti).I bars verdi indicanu frammenti cù l'energii Rosetta sopra à u limitu è ​​dunque menu prubabile di furmà zippers steric.I frammenti chì cuntenenu proline sò stati esclusi da l'analisi (senza colonne).I quadrati indicanu e zone di amiloidosi previste da l'algoritmu Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).A sequenza di residui d'aminoacidi di NT hè in cima, è i tipi di residui truvati in a struttura secundaria β (determinata da spettroscopia RMN di u statu solidu) sò mostrati in rossu.Les positions des cinq NT α-hélices sont désignées comme (H1-H5)28.
A pH <6,5, l'HT dimerizza, essendu resistente à a denaturazione indotta da u calore o da urea18.Per elucidare cumu a dimerizazione è a stabilità di NT affettanu a gelazione, i suluzioni chì cuntenenu 100 mg / ml NT sò stati cuntrullati à pH 8, 7 è 6 cù a prova d'inversione di vial.NT samples incubated at pH 8 and 7 gelled after 30 min at 37 ° C, ma u pH 8 gel si firmò chjaru, mentri u pH 7 gel dimustrava un precipitatu visibile (Fig. 5a).In cuntrastu, una suluzione chì cuntene HT à pH 6 ùn hà micca furmatu un gel, è un grande precipitatu pò esse vistu dopu à 20 min à 37 ° C.Questu suggerisce chì i dimeri stessi è / o a so stabilità più altu cumparatu cù i monomeri impediscenu a gelazione.La formation d'un précipité pour le NT à pH 7 et 6 n'était pas attendue, puisqu'il a été rapporté que le NT est soluble à 200 mg/ml27, se replie facilement après dénaturation thermique, et conserve également une hélice α à des valeurs inférieures de pH 18. Una spiegazione prubabile per queste discrepanzi hè chì l'esperimenti rappurtati prima sò stati realizati à a temperatura di l'ambienti o sottu, o in cuncentrazione di proteina relativamente bassa16,18,19.
Test d'inversione di fiala NT (100 mg/mL) à pH 8, 7, 6 è 154 mM NaCl (pH 8) dopu incubazione à 37 ° C.b NT CD spettri cù e senza 154 mM NaF è 154 mM NaCl, rispettivamente.L'ellitticità molare à 222 nm hè cunvertita in una proporzione di pieghe naturali.c Test d'inversione NT (100 mg/mL) NT* (37 °C e 60 °C), NTA72R (37 °C) e His-NT-L6 (37 °C e 60 °C).d spettri CD di NT mutanti NT*, NTA72R, è His-NT-L6.L'ellitticità molare à 222 nm hè cunvertita in una proporzione di pieghe naturali.e Test d'inversione di NTFlSp, NTMiSp è NTMiSp ridutta (100 mg/mL).Scala bar 5 mm.f spettri CD di NT, NTFlSp, NTMiSp è NTMiSp ridotti.L'ellitticità molare à 222 nm hè cunvertita in una proporzione di pieghe naturali.I spettri NT cumpleti à 25 ° C è 95 ° C sò mostrati in a Figura Supplementaria 8.
A concentrazione fisiologica di u sali determina l'interazzione elettrostatica trà e subunità NT è a dimerizazione di u trasferimentu di NT à pH18 più bassu.Avemu trovu chì a prisenza di 154 mM NaCl è NaF hà daveru impeditu a gelazione, rispettivamente (Fig. 5a, b; Supplementary Fig. 2b) è chì questi sali anu aumentatu a stabilità termale di i monomeri NT (Fig. 5b, Supplementary Fig. 8) .Suggerisce ancu chì a crescita di stabilità, invece di dimerizazione, impedisce a furmazione di gel.
Per scopre più u rolu di a dimerizazione di a proteina è a stabilità in a gelazione, avemu usatu dui mutanti, NT * è NTA72R, chì restanu ancu monomerichi à pH 28.30 bassu.NT * hè un mutante d'inversione di doppia carica in u quale a distribuzione apparente di carica dipolari di u monomeru hè appiattata, chì impedisce a dimerizazione è aumenta drasticamente a stabilità di monomeru.NTA72R hè un dipolu caricatu, ma l'Ala Arg-sustituitu hè situatu à u cunfini dimeru, cusì e mutazioni interferiscenu cù l'interazzione di subunità necessaria per a dimerizazione.À l'incubazione à 37 ° C, NT * ùn hà micca furmatu un hydrogel, mentri NTA72R hà furmatu un gel opacu per 15 min (Fig. 5c).Siccomu NT * è NTA72R ùn pò micca dimerize, ma differ in a stabilità di monomeru (Fig. 5d), sti risultati suggerenu fermamente chì l'alta stabilità termodinamica impedisce NT da gelling.Questu hè ancu sustinutu da u fattu chì HT * forma un gelu quandu hè inestabile à alta temperatura (dopu à 8 min à 60 ° C; Fig. 5c).Hè statu dimustratu prima chì l'altu cuntenutu di methionine in NT liquefies u so plegamentu naturali è chì sei sustituti Met à Leu (riferitu quì His-NT-L6) stabilizzanu fermamente u monomeru NT46.Basatu nantu à l'assunzione chì a flessibilità strutturale hè necessaria per a furmazione di gel NT, avemu trovu chì u mutante stabile His-NT-L6 ùn si gelava à 37 ° C (Figura 5c, d).In ogni casu, His-NT-L6 hà ancu furmatu un gel nantu à l'incubazione à 60 ° С per 60 min (Fig. 5c).
L'abilità di NT per trasfurmà in strutture β-sheet è forma idrogeli pare applicà à alcuni ma micca tutti i domini NT di spidroin.NTs da diversi tipi di sita è spezie di spider, Trichonephila clavipes (NTFlSp), furmate gels malgradu u so cuntenutu relativamente bassu di metionina è una alta stabilità termale (Fig. 5e, f è Supplementary Table 2).In cuntrastu, NT da a piccula proteina ampullar spidroin da Araneus ventricosus (NTMiSp) cù una stabilità termale bassa è un altu cuntenutu di metionina ùn anu micca furmatu hydrogels (Tavola Supplementaria 2 è Fig. 5e, f).L'ultime pò esse assuciatu cù a prisenza di ligami disulfuri intramoleculari29,47.In cunsistenti, quandu i ligami disulfide di NTMiSp sò ridotti, si furmò un idrogelu dopu l'incubazione à 37 ° C per 10 min (Fig. 5e).In cunclusioni, deve esse nutatu chì a flessibilità strutturale hè un criteriu impurtante, ma micca solu, per a furmazione di un gel da NT.Un altru fattore chì pò esse pertinenti hè a propensione à furmà fibrille amiloide, è l'analisi cù a basa di dati di zipper è l'algoritmu Waltz hà dimustratu una correlazione trà a capacità di furmà geli è a presenza di regioni amiloidogeniche, è ancu l'estensione di e regioni previste. per furmà cerniere sterica.Ci era una correlazione (Table Supplementary 2 è Supplementary Fig. 9).
A capacità di NT per furmà fibrilli è furmà gels in cundizioni favurevuli ci hà purtatu à l'ipotesi chì e fusioni NT cù altri frammenti di proteini ponu ancu formate gels cù a funzione cumpleta di i partenarii di fusione.Per pruvà questu, avemu introduttu a proteina fluorescente verde (GFP) è a fosforilasi di nucleosidi purina (PNP) à u C-terminale di u NT, rispettivamente.E proteine ​​​​di fusione risultanti sò state espresse in E. coli cun rendimenti finali assai elevati (150 mg/L è 256 mg/L di culture in fiaschetta agitata per His-NT-GFP è His-NT-PNP, rispettivamente), in cunfurmità cù ciò chì hè statu dimustratu. per Altre proteine ​​fuse a NT Ref.30. A proteina di fusione His-NT-GFP (300mg/mL) è His-NT-PNP (100mg/mL) formanu gels dopu à 2 ore è 6,5 ore à 37 ° C è, più impurtante, a frazzioni GFP restava invariata.osservatu dopu a gelazione, cù> 70% di l'intensità di fluoriscenza iniziale chì resta dopu à a gelazione (Fig. 6a).Per misurà l'attività di PNP in i so suluzioni è i geli-NT-PNP, avemu avutu a diluzione di a proteina di fusione cù NT perchè l'attività enzimatica di a preparazione pura era fora di a gamma di rilevazione di l'assay à cuncentrazioni di gelling.U gelu furmatu cù una mistura chì cuntene 0.01 mg / mL His-NT-PNP è 100 mg / mL NT retenu 65% di l'attività enzimatica iniziale di i campioni preincubati (Fig. 6b).U gelu ferma intactu durante a misurazione (Figura supplementaria 10).
a Intensità di fluorescenza relativa prima è dopu a gelificazione di His-NT-GFP (300 mg/mL) è vial invertitu chì cuntene l'idrogelu His-NT-GFP (300 mg/mL) sottu luce visibile è UV.I punti mostranu misurazioni individuali (n = 3), e barre d'errore mostranu a deviazione standard.U valore mediu hè indicatu in u centru di e barre d'errore.b L'attività PNP hè stata ottenuta da l'analisi fluorimetrica cù suluzioni è gels custituiti da NT (100 mg/ml) è una mistura chì cuntene 0,01 mg/ml his-NT-PNP è 100 mg/ml New Taiwan dollars.L'inseritu mostra una fiala invertita chì cuntene un idrogelu chì cuntene His-NT-PNP (barra di scala 5 mm).
Quì, raportemu a furmazione di idrogeli da NT è altre proteine ​​​​di spidroin ricombinanti incubando una soluzione di proteina à 37 ° C (Figura 1).Mostramu chì a gelazione hè assuciata cù a trasfurmazioni di α-helices in β-layers è a furmazione di fibrilli amiloidi (Figs. 3 è 4).Questa scuperta hè surprisante chì i NT sò fasci di cinque hélice globulari in spirale cunnisciuti per a so solubilità estremamente alta è alta stabilità à cuncentrazioni > 200 mg/mL à 4 ° C per parechji ghjorni27.Inoltre, i NT si ripieghenu facilmente dopu a denaturazione di u calore à bassa concentrazione di proteina in µM.Sicondu i nostri risultati, a furmazione di fibrilla hè bisognu di una cumminazzioni di cuncintrazione di prutezione > 10 mg / mL è a temperatura ligeramente elevata (Fig. 1).Questu hè coherente cù l'idea chì i fibri amiloidi ponu formate da e proteine ​​​​globularly plegate chì sò in un statu parzialmente unfolded per via di fluttuazioni termali in cundizioni fisiulogichi 48 .Esempii di proteini chì sottumettenu sta cunversione includenu l'insulina49,50, β2-microglobulina, transtiretina è lisozima51,52,53.Ancu s'ellu NT hè una α-helix in u so statu nativu, circa 65% ​​di a catena polipeptidica hè cumpatibile cù a furmazione di zipper steric (Fig. 4e) 45 .Siccomu u monomeru hè dinamicamente mobile46, pò espose queste regioni amiloidogeniche potenziali à temperature moderatamente elevate è à alta concentrazione di proteina tutale pò ghjunghje à una cuncentrazione critica per a furmazione di fibrilla amiloide54.Dopu stu ragiunamentu, avemu trovu una correlazione negativa trà a cuncentrazione di spidroin è u tempu di gelazione (Fig. 1c), è se a conformazione monomerica NT hè stabilizzata sia da mutazioni (NT *, His-NT-L6) sia da l'aghjunzione di u sali, pò impedisce u formazione hydrogels (Fig. 5).
In a maiò parte di i casi, fibrilli amiloidi sparisce da a suluzione cum'è un precipitatu, ma in certi cundizioni ponu formate hydrogels55,56,57.I fibrille chì formanu l'idrogel anu tipicamente un altu rapportu d'aspettu è formanu rete tridimensionale stabile per mezu di l'intrecciu moleculare, 55,58 coherente cù i nostri risultati.Per a furmazione di l'idrogel in vitro, i proteini sò spessu sbulicati in tuttu o parzialmente, per esempiu, per l'esposizione à solventi organici, alta temperatura (70-90 ° C) è / o pH bassu (1,5-3,0) 59,60,61,62.L'idrogeli spidroin descritti quì ùn anu micca bisognu di trasfurmazioni duru, nè ùn anu micca bisognu di agenti di cross-linking per stabilizzà l'idrogels.
Hè statu rappurtatu prima chì i ripetizioni di spidroin è QD, chì parenu sottumessi à un cambiamentu di foglia β durante a filatura di seta, formanu idrogeli.Comparatu à i nostri risultati, i tempi d'incubazione è / o e temperature di incubazione eranu significativamente più longu o più altu, rispettivamente, è l'idrogeli resultanti eranu spessu opachi (Figura 7 è Tabella Supplementaria 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68. , 69. In più di i tempi di gel rapidu, l'idrogeli NT> 300 mg/mL (30%) anu superatu tutti l'altri idrogeli di proteine ​​​​di seta di spider recombinante descritte, è ancu l'idrogeli naturali cum'è gelatina, alginate (2%), agar (0,5 %). ) è u collagene.(0,6%) (Figura 7 è Tavule Supplementari 1 è 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
U tempu di gelu è u modulu elasticu di l'idrogeli in stu studiu sò stati paragunati cù altri idrogeli basati in spidroin è idrogeli naturali selezziunati.I riferimenti sò datu cù una descrizzione di e cundizioni di gelazione.APS Persulfate d'ammonium, température ambiante.Dati 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
L'armi parenu avè sviluppatu modi per prevene a spidroin da gelling durante u almacenamentu.Malgradu l'alta concentrazione di prutezione in a glandula di sita, a grande regione di ripetizione assuciata à u duminiu terminal significa chì a cuncintrazione apparente di NT è CT in a glandula currisponde à circa 10-20 mg / ml, à u cunfini di stu studiu.necessariu per a furmazione di idrogel osservata in vitro.Inoltre, cuncintrazioni simili di sali 16 stabilizati NT, cum'è in glànduli di sita (Fig. 5b).A cunfurmazione NT hè stata studiata in u citosol di E. coli è hè stata trovata più strettu ch'è quandu esaminata in vitro, chì indica ancu chì u sali o altri fattori impediscenu a so aggregazione in vivo.In ogni casu, a capacità di i NT per trasfurmà in fibrille β-sheet pò esse impurtante per a furmazione di filamenti è deve esse investigatu in studii futuri.
In più di l'aspetti novi di fibrilla NT-amiloid-like è a furmazione di l'idrogel osservati in stu studiu, avemu ancu mostra chì stu fenomenu pò avè applicazioni biotecnologichi è biomedicali (Fig. 8).Cum'è una prova di cuncettu, avemu cumminatu NT cù GFP o PNP è hà dimustratu chì a proteina di fusione forma ancu idrogeli quandu incubata à 37 ° C è chì e frazioni GFP è PNP mantenenu largamente a so attività dopu a gelazione (Figura 6).I nucleosidi fosforilasi sò impurtanti sintesi di catalizzatori di analoghi nucleosidi75, chì rende a nostra scuperta pertinente per l'industria biofarmaceutica.U cuncettu di l'espressione di proteine ​​​​di fusione chì formanu idrogeli trasparenti in cundizioni favurevuli permette a creazione di idrogeli funzionalizzati cù proprietà favurevuli per una larga gamma di applicazioni cum'è l'immobilizazione enzimatica, a liberazione cuntrullata di droga è l'ingegneria tissutale.Inoltre, NT è NT * sò marcatori di espressione efficaci30, chì significa chì NT è e so varianti ponu esse aduprati per a produzzione d'alta produzzione di proteine ​​​​di fusione solubili è a creazione successiva di proteine ​​​​di destinazione immobilizzate in idrogeli 3D.
Le NT est soluble, α-hélicoïdal et stable à basses concentrations (µM) et à 37°C.À a listessa temperatura, ma à cuncentrazione crescente (> 10 mg/ml), NT forma geli custituiti da fibrille amiloide.E proteine ​​di fusione NT formanu ancu gel fibrillari cù frammenti di fusione cumplettamente funzionali, chì permettenu l'immobilizazione di diverse proteine ​​​​in idrogeli 3D cù NT.Bottom: NT (PDB: 4FBS) è illustrazioni di rete di fibre è strutture di prutezione assuciate (assume è micca disegnati à scala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
I custruzzioni (vede a Tabella Supplementaria 4 per una lista completa chì includenu sequenze di aminoacidi) sò stati clonati in u plasmid pT7 è trasfurmati in E. coli BL21 (DE3).E. coli chì cuntenenu plasmidi ingegneriali sò stati inoculati in u brodu di Luria supplementatu cù kanamycin (70 mg / l) è cultivatu per a notte à 30 ° C è 250 rpm.A cultura hè stata poi inoculata 1/100 in un mediu LB chì cuntene kanamicina è cultivata à 30 ° C è 110 rpm finu à chì l'OD600 hà righjuntu 0,8.Per studii NMR, i battìri sò stati cultivati ​​in un mediu minimu M9 chì cuntene 2 g di D-glucose 13C (Aldrich) è 1 g di clorur d'ammoniu 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) per l'etichettatura di prutezione cù isotopi.Abbassate a temperatura à 20 gradi Celsius è induce l'espressione di a proteina cù 0,15 mM isopropylthiogalactopyranoside (concentrazione finale).Dopu l'espressione di a proteina durante a notte, e cellule sò state raccolte à 7278 × g, 4 ° C per 20 min.I pellets di cellule sò stati risuspenditi in 20 mM Tris-HCl, pH 8, è congelati finu à l'utilizazione.E cellule scongelate sò state lisate cù un disruptore cellulare (macchine di a serie TS, Constant Systems Limited, Inghilterra) à 30 kPa.Allora i lisati sò stati centrifugati à 25.000 g per 30 minuti à 4 ° C.Per NTMiSp, u pellet hè stata risospesa in urea 2 M, 20 mM Tris-HCl, pH 8, è sonicata per 2 min (2 s on/off, 65%), poi centrifugata di novu à 25.000 xg, 4 ° C. 30 min.U supernatant hè stata caricata nantu à una colonna Ni-NTA, lavata cù 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, è infine a proteina hè stata eluita cù 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Per generà NT2RepCT è NTCT, a digestione di trombina introduce u situ (ThrCleav) trà His è NT.I siti di scissione di trombina sò ancu presenti in His-NT-ThrCleav-2Rep (produce 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produce NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produce CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produce NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produce NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produce NTF1Sp) e His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produce NTMiSp).I custruzzioni sò stati digeriti cù trombina (1: 1000) è dializzati per a notte à 4 ° C. cù 20 mM Tris-HCl, pH 8, utilizendu una membrana di dialisi Spectra / Por cù una soglia di pesu moleculare di 6-8 kDa.Dopu a dialisi, a suluzione hè caricata nantu à una colonna Ni-NTA è l'effluent chì cuntene a proteina d'interessu hè recullata.A cuncentrazione di proteina hè stata determinata da a misurazione di l'assorbanza UV à 280 nm utilizendu u coefficiente di estinzione di ogni proteina, eccettu per NTF1Sp, chì hà utilizatu l'assay Bradford secondu u protokollu di u fabricatore.A purezza hè stata determinata da l'elettroforesi in gel SDS poliacrilammide (4-20%) è a colorazione blu brillante Coomassie.I proteini sò stati cuncentrati cù filtri di centrifuga (VivaSpin 20, GE Healthcare) à 4000 xg cù un cutoff di pesu moleculare di 10 kDa in cicli di 20 minuti.
Scongelare la soluzione proteica e pipettare con cura 150 µl in un flaconcino trasparente da 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).I tubi sò stati tappati è sigillati cù parafilm per impediscenu l'evaporazione.I campioni (n = 3) sò stati incubati à 37 ° C o 60 ° C è periodicamente invertiti per osservà a gelazione.I campioni chì ùn anu micca gelatu sò stati incubati per almenu una settimana.Riduce i legami disulfuru NTMiSp cù 10 mM DTT per 10 µM di proteina.Per analizà a gelazione di i rivestimenti di seta di spider naturali, u spider di u ponte svedese hè statu tagliatu, i dui glànduli ampullated principali sò stati posti in 200 μl di 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 è tagliatu per permettà u revestimentu per separà da i glanduli..U cuntenutu di i glanduli sò dissoluti in buffer, 50 µl per a determinazione di u pesu seccu (per incubazione di vials aperti à 60 ° C à u pesu constantu) è 150 µl per a gelazione à 37 ° C.
A geometria / strumentu di misurazione hè fatta di l'acciaio inox cù una piastra parallela cù un diametru superiore di 20 mm è un spaziu di 0,5 mm.Riscalda u campione da 25 °C à 45 °C è torna à 25 °C à una velocità di 1 °C per minutu cù una piastra Peltier di fondu in acciaio inox.E misurazioni di vibrazione sò stati realizati à una freccia di 0.1 Hz è in a regione viscoelastica lineale di u materiale à una tensione di 5% è 0.5% per campioni di 100 mg / mL è 300-500 mg / mL, rispettivamente.Aduprate una camera d'umidità persunalizata per prevene l'evaporazione.I dati sò stati analizati cù Prism 9.
Per a cullezzione di spettri infrarossi (IR) à a temperatura di l'ambienti da 800 à 3900 cm–1.U dispusitivu ATR, cum'è u percorsu di luce attraversu u spettrometru, hè purgatu cù aria filtrata secca prima è durante l'esperimentu.Soluzioni (500 mg/mL per minimizzà i picchi di assorbimentu d'acqua in i spettri) sò stati pipettati nantu à i cristalli, è i geli (500 mg/mL) sò stati furmati prima di a misurazione è poi trasferiti à i cristalli (n = 3).1000 scans sò stati arregistrati cù una risuluzione di 2 cm-1 è u ciculu di duty zero di 2. A seconda derivativa hè stata calculata cù OPUS (Bruker) utilizendu una gamma di smoothing di nove punti.I spettri sò stati nurmalizzati à a listessa regione d'integrazione trà 1720 è 1580 cm-1 cù F. Menges "Spectragryph - Software Spectroscopy Optical".In a spettroscopia ATR-IR, a prufundità di penetrazione di un fasciu infrarossu in un campionu hè dipendente da u numeru d'onda, risultante in un assorbimentu più forte à numeri d'onda più bassi cà à numeri d'onda più alti.Questi effetti ùn sò micca stati corretti per i spettri mostrati in Figs.3 perchè sò assai chjuchi (Figura supplementaria 4).I spettri curretti per questa figura sò stati calculati cù u software Bruker OPUS.
In principiu, una quantificazione cumpleta di cunfurmazioni di a proteina hè pussibule dopu una deconvoluzione affidabile di i cumpunenti in u piccu di l'amide I.Tuttavia, certi ostaculi nascenu in a pratica.U rumore in u spettru pò esse cum'è picchi (falsi) durante a deconvolution.Inoltre, u piccu dovutu à a curvatura di l'acqua coincide cù a pusizione di u piccu di l'amide I è pò avè una magnitudine simili per i campioni chì cuntenenu una grande quantità d'acqua, cum'è u gel aqueous studiatu quì.Dunque, ùn avemu micca pruvatu à scumpressà cumplettamente u piccu di l'amide I, è e nostre osservazioni devenu esse cunsiderate solu in supportu di altri metudi cum'è a spettroscopia NMR.
Soluzioni di 50 mg/ml NT è His-NT2RepCT sò stati gelificati durante a notte à 37 ° C.L'idrogel hè stata poi diluitu cù 20 mM Tris-HCl (pH 8) à una cuncentrazione di 12,5 mg/ml, agitatu bè è pipettatu per rompe u gel.In seguitu, l'idrogelu hè stata diluita 10 volte cù 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl di a mostra hè stata appiicata à una griglia di cobre rivestita cù formvar, è l'excedente di mostra hè stata eliminata cù blotting paper.I campioni sò stati lavati duie volte cù 5 µl d'acqua MilliQ è macchiati cù 1% formatu di uranilu per 5 minuti.Eliminate l'eccessu di macchia cù carta assorbente, poi asciugate a rete à l'aria.L'imaghjini sò stati realizati nantu à queste griglie cù un FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN chì opera à 100 kV.L'imaghjini sò stati registrati à x 26,500 è x 43,000 ingrandimenti cù una camera Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germania).Per ogni mostra (n = 1), 10-15 imagine sò stati registrati.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) hè stata aduprata per l'analisi di l'imaghjini è a misurazione di diametri di fibre (n = 100, fibre diverse).Prism 9 hè stata utilizata per eseguisce teste t senza pari (due coda).A media His-NT2RepCT è NT fibrilli eranu 11.43 (SD 2.035) è 7.67 (SD 1.389) nm, rispettivamente.L'intervallu di cunfidenza (95%) hè -4,246 à -3,275.gradi di libertà = 198, p < 0,0001.
80 µl di campioni liquidi contenenti 10 µM di tioflavina T (ThT) sono stati misurati in triplicato (n = 3) in condizioni statiche usando piastre Corning a fondo trasparente a 96 pozzetti (Corning Glass 3881, USA).E differenze di fluorescenza sò state registrate cù un filtru di eccitazione 440 nm è un filtru di emissione di 480 nm (FLUOStar Galaxy da BMG Labtech, Offenburg, Germania).U signale ThT ùn era nè saturatu nè stintatu, cum'è esperimenti cù diverse concentrazioni di ThT sò stati realizati senza cambià l'intensità di u signale.Registrate l'assorbanza à 360 nm per a misurazione di nebbia.Per l'esperimenti di seeding, 100 mg / mL gels sò stati furmati à 37 ° C., resuspended, è utilizatu per a sementa à proporzioni molari di 5%, 10%, è 20%.I dati sò stati analizati cù Prism 9.
Scongelare le scorte di His-NT2RepCT e NT > 100 mg/mL su ghiaccio e filtrare attraverso un filtru di 0,22 µm.I cuncentrazioni sò stati calculati per misurà l'assorbanza à 280 nm cù Nanodrop.In i pozzi di una piastra nera non vincolante di 96 pozzetti (Corning) cù un fondu chjaru, i campioni sò stati diluiti à 20 mg / ml in 20 mM Tris-HCl pH 8 è mischiati cù 5 μM ThT (concentrazione finale), cuncentrazione tutale di mostra. Volume di 50 μl.I campioni sò stati stampati ogni 10 minuti à 37 ° C in un microscopiu CellObserver (Zeiss) cù un canale di luce trasmessa è filtri di eccitazione è emissione FITC per l'imaghjini ThT.Una lente 20x / 0.4 hè aduprata per l'imaghjini.Zen Blue (Zeiss) è ImageJ (https://imagej.nih.gov/) sò stati usati per l'analisi di l'imaghjini.I gel sò stati ancu preparati da soluzioni NT è His-NT2RepCT à una cuncentrazione di 50 mg/mL chì cuntenenu 20 mM Tris pH 8 è 5 µM ThT è incubati à 37 ° C per 90 min.I pezzi di gel sò stati trasferiti à un novu pozzu chì cuntene 20 mM Tris, pH 8, è 5 μM ThT in una piastra di fondu neru 96 pozzu chjaru senza ligame.Acquisite fluorescenza verde è imagine di campu luminoso à 20x / 0.4 ingrandimentu.ImageJ hè stata utilizata per l'analisi di l'imaghjini.
I spettri NMR di a suluzione sò stati ottenuti à 310 K nantu à un spettrometru Bruker Avance Neo 600 MHz equipatu di un Cryoprobe QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Campioni NMR chì cuntenenu 10 mg/mL di proteina omogenea marcata cù 13C, 15N, dissoluta in 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .I cambiamenti chimichi di NT2RepCT à pH 6.7 sò stati usati per assignà u piccu 23 in u spettru 2D di 15N-HSQC.
I spettri NMR solidi (MAS) di rotazione d'angolo magicu di 13C, idrogeli marcati 15N sò stati registrati in un spettrometru Bruker Avance III HD à 800 MHz equipatu di una sonda senza elettroni 3.2 mm 13C/15N{1H}.A temperatura di l'esempiu hè stata cuntrullata cù un flussu di gasu di temperatura variabile à 277 K. Spettri di resonance rotational dipole bidimensionale (DARR) 76 è di reconnection di radiofrequenza (RFDR) 77 sò stati acquistati à frequenzi MAS di 12.5 kHz è 20 kHz, rispettivamente.A polarizazione incruciata (CP) da 1H à 13C hè stata realizata cù una rampa lineare da 60.0 à 48.0 kHz à 1H, 61.3/71.6 kHz à 13C (à 12.5/20 kHz MAS) è u tempu di cuntattu 0.5-1 ms.Spinal6478 decoupling à 73.5 kHz hè stata utilizata durante a cullizzioni di dati.U tempu d'acquistu era 10 millisecondi è u ritardu di u ciclu era 2.5 seconde.I correlazioni Cα/Cβ uniligati osservati in i spettri RFDR sò stati attribuiti in basa di i cambiamenti chimichi caratteristici di u residuu è e correlazioni multiliate in i spettri DARR.
A basa di dati Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) hè stata aduprata per evaluà i tendenzi di flutter è l'energia Rosetta per NT, NTFlSp è NTMiSp.A basa di dati Zipper calcula Rosetta Energy80, chì combina parechje funzioni d'energia libera per modellà è analizà a struttura di a proteina.Un livellu di energia di -23 kcal / mol o più bassu indica una alta tendenza à fibrillate.L'energia più bassa significa più stabilità di i dui filamenti β in a conformazione di zipper.Inoltre, l'algoritmu Waltz hè statu utilizatu per predichendu e regioni amiloidogeniche in NT, NTFlSp è NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
A suluzione di a proteina NT hè stata mischjata cù u buffer di l'acidu 2-(N-morfolino)ethanesulfonic (MES) à pH 5,5 è 6,0 per calà u pH à pH 6 è 7, rispettivamente.A cuncentrazione di proteina finale era 100 mg / ml.
E misurazioni sò state eseguite nantu à un spettrometru J-1500 CD (JASCO, USA) utilizendu una cuvette da 300 μL cù un percorsu otticu di 0,1 cm.I proteini sò stati diluiti à 10 μM (n = 1) in 20 mM tampone di fosfate (pH 8).Per analizà a stabilità di a proteina in presenza di u sali, i proteini sò stati analizati à a listessa cuncentrazione (n = 1) in 20 mM tampone di fosfate (pH 8) chì cuntene 154 mM NaF o NaCl, rispettivamente.I scans di temperatura sò stati registrati à 222 nm da 25 ° C à 95 ° C cù una velocità di riscaldamentu di 1 ° C / min.A proporzione di proteine ​​​​native plegate hè stata calculata cù a formula (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal).Inoltre, cinque spettri sò stati registrati per ogni mostra da 260 nm à 190 nm à 25 ° C è dopu riscaldamentu à 95 ° C.Cinque spettri sò stati mediati, lisciati è cunvertiti in ellitticità molare.I dati sò stati analizati cù Prism 9.
L'intensità di fluorescenza di His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) hè stata misurata in triplicate (n = 3) in piastre Corning da 96 pozzetti cù un fondu neru trasparente (Corning Glass 3881, USA) in cundizioni statiche.Misura i campioni cù un lettore di piastra basatu in fluorescenza cù una lunghezza d'onda di eccitazione di 395 nm è registra l'emissione à 509 nm prima di gelificazione è 2 ore dopu à 37 ° C.I dati sò stati analizati cù Prism 9.
Purine nucleoside phosphorylase activity test kit (metudu fluorimetricu, Sigma Aldrich) hè stata utilizata secondu l'istruzzioni di u fabricatore.Per misurà l'attività in gel è soluzioni chì cuntenenu His-NT-PNP, mischjà 10 ng di His-NT-PNP cù 100 mg/mL NT à un volume tutale di 2 µL perchè u gel hà datu un signalu sopra l'intervallu di rilevazione di u set.I cuntrolli per i gel è suluzione senza His-NT-PNP sò stati inclusi.E misurazioni sò state realizate duie volte (n = 2).Dopu chì l'attività hè stata misurata, a mistura di reazzione hè stata eliminata è u gelu fotografiatu per assicurà chì u gelu ferma intactu durante a misurazione.I dati sò stati analizati cù Prism 9.
Per più infurmazione nantu à u disignu di studiu, vede l'astrattu di studiu di Natura ligatu à questu articulu.
I figuri 1 è 2 presentanu i dati iniziali.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, è 6, Figuri Supplementari.3, fig.5a, d, fig.6 è fig supplementari.8. Dati Dati da stu studiu hè ospitu in a basa di dati Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.I dati NMR ottenuti in stu studiu sò stati publicati in u repository BMRBig sottu l'ID d'entrata bmrbig36.E strutture di GFP è PNP sò state pigliate da PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
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