ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tubu Saldatu Duplex Per a componente chimica di l'Industria Chimica, A carenza di SPECC1L porta à una stabilità aumentata di l'articulazioni spliced ​​è riduzzione di e cellule di cresta neurale craniale.

Grazie per visità Nature.com.Aduprate una versione di navigatore cù supportu CSS limitatu.Per a megliu sperienza, ricumandemu chì utilizate un navigatore aghjurnatu (o disattivà u Modu di Compatibilità in Internet Explorer).Inoltre, per assicurà un supportu continuu, mostramu u situ senza stili è JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tubu Saldatu Duplex Per Industria Chimica

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.hè un fabricatore di punta chì hè specializatu in tubi senza saldatura in acciaio inox, tubi ricotti brillanti, tubi spiralati senza saldatura, ecc.Per fà facilità i clienti, avemu saldatu ancu tubi è tubi.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.hà l'equipaggiu di pruduzzione è teste più avanzati.Pudemu cumplettamente i vostri bisogni.Sicondu u standard assai strettu, i tubi pruduciuti da noi anu sempre una tolleranza OD è WT curretta.U cuntrollu di tolleranza hè strettamente in cunfurmità per pruduce standard.I nostri prudutti sò sempre soddisfatti di i clienti.I clienti anu acquistatu i nostri prudutti creanu più prufitti.
a) OD (Diametru Esternu): 3,18 mm à 101,6 mm
b) WT (spessore di u muru): da 0,5 mm à 20 mm
c) Lunghezza: Sicondu u requisitu di u cliente
d) Norme: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ecc
e) Metodu di prucessu: ERW, EFW etc

Sliders chì mostranu trè articuli per slide.Aduprate i buttuni di u ritornu è u prossimu per passà per e diapositive, o i buttoni di u controller di slide à a fine per passà per ogni slide.
E cellule di a cresta neurale craniale (CNCC) si sguassate da e pieghe neurali embrionali è migranu à l'archi faringeali, chì formanu a maiò parte di e strutture midface.A disfunzione di CNCC ghjoca un rolu impurtante in l'etiologia di a fessura orofacial, una malformazione congenitale cumuni.Eterozygous SPECC1L mutazioni sò stati trovati in i malati cù clefts atipici è sindromi.Quì, raportemu una colorazione rinfurzata di cumpunenti di giunzione adesiva canonica (AJ), β-catenina è E-cadherina in cellule coltivate SPECC1L knockdown, è e micrografie elettroniche mostranu a diffusione apicale-basale di AJ.Per capisce u rolu di SPECC1L in a morfogenesi craniofacial, avemu creatu un mudellu di mouse deficientu Specc1l.I mutanti omozigoti sò letali embrionali è mostranu una chiusura di tubu neurale alterata è una laminazione CNCC.A colorazione di a proteina AJ hè aumentata in i pieghe neurali mutanti.Stu difettu AJ hè coherente cù un difettu in a delaminazione CNCC, chì richiede a dissoluzione AJ.Inoltre, i mutanti Specc11 anu riduciutu a signalazione di PI3K-AKT è anu aumentatu l'apoptosi.In vitro, una ligera inibizione di a signalazione PI3K-AKT in e cellule di tipu salvaticu hè stata abbastanza per induce cambiamenti AJ.Impurtante, i cambiamenti AJ indotti da SPECC1L knockdown ponu esse invertiti da l'attivazione di a via PI3K-AKT.Inseme, sti dati suggerenu chì SPECC1L, cum'è un novu regulatore di a signalazione PI3K-AKT è a biologia AJ, hè necessariu per a chiusura di u tubu neurale è a stratificazione CNCC.
I cellule di cresta neurale craniale (CNCC) si localizzanu à u neuroectoderma dorsale è si staccanu da u neuroepiteliu di i pieghe neurali in sviluppu attraversu un prucessu chì implica a transizione epiteliale-mesenchimale (EMT)1,2,3.I CNCC epiteliali premigranti disturbanu e giunzioni intercellulari è diventanu CNCC mesenchimali migratori chì riempianu u primu è u sicondu archi faringei è formanu a maiò parte di u cartilagine craniofacial.Cusì, i genesi chì regulanu a funzione CNCC sò spessu disturbati in l'etiologia di l'anomali congenitali craniofaciali, cum'è i clefts orofaciali, più cumunimenti chì affettanu 1/800 nascita in i Stati Uniti solu.Una di e deformità congenitali8.
A delaminazione di u CNCC coincide cù a chjusura di u tubu neurale anteriore trà 8,5 è 9,5 ghjorni di sviluppu embrionicu in i topi.I mutanti di una quantità di geni associati à una fessura orofacciale di u mouse mostranu ancu una forma di difettu di u tubu neurale, cumprese Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, è Pdgfrα12.In ogni casu, i prucessi di chjusu di u tubu neurale è a stratificazione CNCC ponu esse cunsiderati indipendenti, postu chì u mouse mutante Splotch (Pax3) mostra difetti in a chiusura di u tubu neurale senza alcun effettu nantu à a stratificazione CNCC o a migrazione 13,14.Modelli di mouse supplementari cù difetti in a dissezione CNCC è a chiusura di u tubu neurale aiutanu à delineà a basa moleculare cumuna di sti dui prucessi.
L'isolazione di CNCC da cellule neuroepiteliali richiede la dissoluzione di giunzioni adesive (AJ), che sono composte da complessi proteici contenenti, tra l'altro, E-cadherina, β-catenina, α-E-catenina e α-actinina associata a filamenti di actina 2 Studii di sovraespressione E-cadherina in i plegamenti neurali anu dimustratu una riduzione o ritardu in a delaminazione CNCC.À u cuntrariu, a suppressione di E-cadherin risultati in una stratificazione iniziale15,16.Molti di i fatturi chì medianu l'EMT durante a stratificazione CNCC sò fattori di trascrizione (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) è proteine ​​​​di rimodulazione di a matrice extracellulare (ECM) cum'è i metalloproteinasi di matrice (MMPs), ma i CNCCs sò i regulatori diretti di AJ citoscheletali. micca ancu cunnisciutu.A via PI3K-AKT hè cunnisciuta per antagonizà i livelli di E-cadherina, principalmente da a ricerca di u cancer17.Studi recenti anu dimustratu chì a perdita di signalazione PI3K-AKT basata in PDGFα in i topi porta à anomalie craniofaciali, cumpresi i difetti di u palatu fenditu è ​​u tubu neural12.Tuttavia, a relazione trà a via PI3K-AKT è a stabilità AJ nantu à a stratificazione CNCC ùn hè micca chjaru.
Avemu prima identificatu SPECC1L cum'è u primu genu mutante in dui persone cù una fessura severa chì si estende da a bocca à l'ochju, cunnisciuta cum'è fessura oblique (ObFC) o Tessier IV18 cleft.Mutazioni SPECC1L sò state identificate in duie famiglie multigenerazionale cù u sindromu Opitz G / BBB autosomale dominante (OMIM # 145410), in quale l'individui affettati mostravanu iperdistanza è labbro / palato leporino19, è in una famiglia cù sindromu di overdistance Tibi (OMIM # 145420)20 .più di a mità di i casi di u sindromu di Opitz G / BBB sò X-linked (OMIM #300000) è sò causati da mutazioni in u genu MID1, chì codifica a proteina 22 di u scheletru di cellula associata à i microtubuli.Ipotisemu chì SPECC1L, ancu una proteina assuciata à i microtubuli è u citoscheletru di l'actina, pò mediate a signalazione necessaria per a remodelazione di u citoscheletru di l'actina durante l'adesione cellulare è a migrazione 18 .Per mezu di studii in vitro è in vivo, avemu avà discrittu SPECC1L cum'è un novu regulatore di a stabilità AJ attraversu a signalazione PI3K-AKT.À u livellu cellulare, a carenza di SPECC1L hà risultatu in una diminuzione di u livellu di a proteina pan-AKT è un aumentu di a dispersione apicale-basale di AJ, chì hè stata eliminata da l'attivazione chimica di a via AKT.In vivo, l'embrioni carenti di Specc11 mostranu una chiusura di tubu neurale alterata è una dissezione CNCC ridotta.Cusì, SPECC1L funziona in una signalazione basata nantu à l'adesione cellulare altamente regulata necessaria per a funzione CNCC normale durante a morfogenesi faciale.
Per caratterizà u rolu di SPECC1L à u livellu cellulare, avemu usatu a linea cellulare stabile di osteosarcoma descritta prima U2OS deficient in SPECC1L18.Queste cellule U2OS stabile cù SPECC1L (kd) knockdown anu avutu una diminuzione moderata (60-70%) in i livelli di transcripts SPECC1L è proteini, inseme cù difetti in migrazione è riurganizazione di u citoscheletru di l'actina 18. In cuntrastu, una severa diminuzione transitoria in SPECC1L hè statu dimustratu per purtà à difetti mitotichi 23 .Dopu una ulteriore carattarizazione, avemu trovu chì e nostre cellule stabili SPECC1L-kd cambiavanu a morfologia à un altu gradu di cunfluenza (Figura 1).Cellule di cuntrollu individuali è cellule kd à bassa cunfluenza parevanu simili (Figura 1A, D).24 ore dopu à a fusione, i celluli di cuntrollu mantenenu a so forma cuboidale (Fig. 1B, E), mentre chì e cellule SPECC1L-kd allungate (Fig. 1C, F).L'estensione di stu cambiamentu in a forma di e cellule hè stata catturata da l'imaghjini in vivo in vivo di e cellule di cuntrollu è e cellule kd (filmu 1).Per determinà u rolu di SPECC1L in e cellule confluenti, avemu prima esaminatu a so espressione.Avemu trovu chì i livelli di proteina SPECC1L anu aumentatu annantu à a fusione (Figura 1G), mentre chì i livelli di trascrizione SPECC1L ùn anu micca aumentatu (Figura 1H).Inoltre, cum'è a densità di a cellula aumentava, a proteina SPECC1L s'hè accumulata à e fruntiere intercellulari (Fig. 2A-E), cù un patronu chì si sovrappone cù quellu di a β-catenina associata à a membrana (Fig. 2A'-E').Data l'associazione di SPECC1L cù u citoscheletru di actina 18,23 avemu ipotisatu chì SPECC1L interagisce cù junctions adesivi basati in actina (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown cells (DF) s'allunganu à alta confluenza (F) cumparatu cù u cuntrollu di e cellule U2OS (AC).Mostrati quì sò trè di i sei punti di tempu (T1, T3, T6) chì avemu sceltu per diverse densità di cellula.(G) L'analisi Western blot chì mostra chì a proteina SPECC1L hè stabilizzata à un altu gradu di cunfluenza cumparatu à un bassu gradu di cunfluenza in e cellule di cuntrollu.Western blot di SPECC1L mostra a banda prevista di 120 kDa è una banda di pesu moleculare più altu, possibbilmente modificata post-traduzzione (*).L'analisi Western blot hè stata realizata in e stesse cundizioni per a cunfluenza bassa è alta.L'imaghjini chì mostranu SPECC1L à bassa è alta cunfluenza sò stati pigliati da a stessa macchia.U listessu blot hè statu eliminatu è riexaminatu cù l'anticorpu β-actin.(H) L'analisi quantitativa RT-PCR ùn hà micca mostratu cambiamenti significativi in ​​i livelli di trascrizione SPECC1L.E barre d'errore rapprisentanu SEM da quattru esperimenti indipendenti.
(AE) Avemu sceltu sei punti di tempu (T1-T6) chì rapprisentanu una gamma di densità di cellule per nurmalizà l'analisi di a forma di e cellule è i cambiamenti AJ in e cellule U2OS cù SPECC1L knockdown (kd).I primi cinque di sti punti di u tempu includenu cellule singole (T1), fusione di 50-70% di clusters di picculi cellule (T2), fusione senza rinfurzà e cellule kd (T3), riformulazione di cellule kd (T4) è cambiamenti di 24 ore.in a forma posteriore di cellule kd (T5).A proteina SPECC1L hè stata principarmenti dispersa in u citoplasma in T1 (A), ma a so accumulazione hè stata osservata à i cunfini intercellulari in i punti temporali successivi (B-E, frecce).(FJ) La β-catenina mostra una accumulatione simile ai limiti intercellulari associati al complesso AJ.(A'-E') SPECC1L et β-caténine présentent une coloration chevauchante aux bords des cellules à haute densité cellulaire (flèches).(F'-J') In cellule SPECC1L-kd, a colorazione di β-catenina appare normale à bassa densità di cellule (F'-H'), ma si espande cum'è a forma di a cellula cambia (I', J'; frecce), chì indicanu chì AJ anu cambiatu.Barres = 10 µm.
Dopu avemu pruvatu à determinà l'effettu di a carenza di SPECC1L nantu à AJ.Avemu usatu parechji marcatori associati à l'AJ, cumprese i cumpunenti canonichi F-actin, myosin IIb, β-catenin, è E-cadherin24,25,26,27.I fibri di stress di l'actina anu aumentatu in e cellule SPECC1L-kd cum'è descrittu prima (Fig. 3A, B) 18 .Myosin IIb assuciatu à i filamenti di l'actina hà dimustratu un aumentu simili in i celluli SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).A β-catenina assuciata à l'AJ s'unisce à a cadherina à a membrana di a cellula, chì mostra un mudellu d'espressione normale di "favo" in i cubociti di cuntrollu (Fig. 3E, G).Curiosamente, in l'imaghjini piani chì utilizanu microscopia confocal, β-catenin (Fig. 3E, F) è E-cadherin (Fig. 3G, H) staining in a membrana cellulare di cunfluenti SPECC1L-deficient cells mustrò mudelli prominenti di staining allargatu.Questa espansione di a tintura di β-catenina assuciata à l'AJ in i celluli kd era più pronunzianu à a cunfluenza, ma pareva precede i cambiamenti in a forma di a cellula (Fig. 2F-J, F'-J').Per determinà a natura fisica di sta tintura AJ estesa, avemu esaminatu i cunfini di e cellule nantu à a superficia apicale-basale di e cellule SPECC1L-kd U2OS per microscopia elettronica di trasmissione (TEM) (Figura 3I, J).In cuntrastu à i celluli di cuntrollu (Fig. 3I), chì avianu regioni densi elettroni separati indicative di AJ (frecce), i celluli kd (Fig. 3J) mostranu grandi regioni contigue di alta densità elettronica indicativa di AJ longu u pianu apicobasal..Inoltre, nantu à e seccioni trasversali, avemu osservatu folds extensive di a membrana cellulare in i kd cells (Fig. S1A, B), chì spiega u mudellu estensu di β-catenin and E-cadherin staining bands (Fig. 3F, H).In supportu di u rolu di SPECC1L in AJs, β-catenina hè stata co-immunoprecipitated with SPECC1L in lysates of confluent U2OS cells (Fig. 3K).Inseme à l'immunostaining allargatu per i marcatori AJ, l'analisi TEM era coherente cù a nostra ipotesi chì a carenza di SPECC1L aumenta a densità è a varianza apicale-basale AJ.
(AH) Aumento della colorazione di F-actina in cellule kd a 48 ore post-fusione (T6; A, B).Colorazione alterata di miosina IIb associata à F-actina (C, D).Le modèle lisse de la coloration des membranes β-caténine et E-cadhérine dans les cellules de contrôle (E, G) a été amélioré dans les cellules SPECC1L-kd (F, H).Barres = 10 µm.(I-J) Micrografie elettroniche chì osservanu a giunzione intercellulare apicale-basale.I celluli di cuntrollu mostranu regioni distinti di densi elettroni chì indicanu junctions sticky (I, frecce).In cuntrastu, tutta a junction apicale-basale in e cellule SPECC1L-kd pareva densu di l'elettroni (J, frecce), chì indicanu una densità aumentata è a dispersione di junctions adesivi.(K) La β-catenine a été co-immunoprécipitée avec SPECC1L dans des lysats cellulaires U2OS confluents.Image presa da un locu chì rapprisenta unu di quattru esperimenti indipendenti.
Per capisce u rolu di SPECC1L in a morfogenesi craniofacial, avemu criatu un mudellu di mouse deficientu Specc1l utilizendu duie linee di cellule di trappula ES indipendenti, DTM096 è RRH048 (BayGenomics, CA), chì rapprisentanu l'intron 1 è i transcripts Specc1l sò stati captu à 15 (Fig. 1). .4A, figura S2).U locu genomicu di l'inseritu di vettori di decoy hè stata determinata da a sequenza di genoma sanu è cunfirmata da PCR (Fig. S2).I dui disinni di trappule di geni permettenu ancu a fusione in-frame di i ghjurnalisti Specc11-lacZ dopu a cattura.Dunque, l'espressione lacZ determinata da a tintura X-gal hè stata aduprata cum'è un indicatore di l'espressione Specc11.I dui alleli anu mostratu mudelli di espressione lacZ simili, cù a trappula di gene DTM096 in l'intron 1 chì mostra una espressione più forte di RRH048 in l'intron 15 (micca mostratu).Tuttavia, Specc1l hè largamente spressione, cù una espressione particularmente forte in i pieghe neurali in E8.5 (Figura 4B), in u tubu neurale è prucessi faciale à E9.5 è E10.5 (Figura 4C, D), è in u sviluppu di i membri. à E10.5 è l'ochji (Figura 4D).Avemu infurmatu prima chì l'espressione SPECC1L in u primu arcu faringeale à E10.5 era presente in l'epiteliu è u mesenchyme18 sottostante, in cunfurmità cù a linea CNCC.Per pruvà l'espressione SPECC1L in CNCC, avemu realizatu E8.5 pieghe neurali (Figura 4E-J) è sezioni di craniu E9.5 (Figura 4K-).À E8.5, SPECC1L stained neural folds intensamente (Fig. 4E, H), inclusi i celluli macchiati cù marcatori NCC (Fig. 4G, J).À E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) fermamente macchiata migrating CNCC co-stained cù AP2A (Fig. 4L, M) o SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Rappresentazione schematica di u genu Specc11 di u mouse chì mostra l'inserzione di vettori di decoy in cloni di cellule ES DTM096 (intron 1) è RRH048 (intron 15).(BD) tintura lacZ di embrioni eterozigoti Specc1lDTM096 chì rapprisentanu l'espressione Specc1l da E8.5 à E10.5.NE = neuroectoderma, NF = piega neurale, PA1 = primo arco faringeo.(EP) Immunocolorazione SPECC1L cù marcatori NCC AP2A è SOX10 in E8.5 (NF; EJ) pieghe neurali è E9.5 (KP) sezioni di craniu.A colorazione SPECC1L hè stata largamente osservata in i pieghe neurale E8.5 (E, H; punte di freccia), cumprese cellule marcate cù AP2A (F, G; punte di freccia) è SOX10 (I, J; punte di freccia).À E9.5, SPECC1L hà fortemente macchiatu CNCC migratori (K, N; frecce) marcati AP2A (L, M; frecce) è SOX10 (O, P; frecce).
L'attraversu trà i topi eterozigoti Specc1lDTM096/+ è Specc1lRRH048/+ mostra chì i dui alleli di trappola di geni ùn sò micca cumplementarii è chì l'eterozigoti composti è l'omozigoti embrionali per l'allele di trappola genica sò letali embrionali (Tabella S1).I rapporti mendeliani indicanu una diminuzione di a sopravvivenza di l'heterozigoti à a nascita (espettatu 1.34 versus 2.0).Avemu nutatu bassa mortalità perinatale trà heterozygotes, certi anu anomali craniofacial (Fig. S3).Tuttavia, a bassa penetranza di questi fenotipi craniofaciali perinatali rende difficiule di studià i so meccanismi fisiopatologichi sottostanti.Dunque, avemu focu annantu à u fenotipu letale embrionali di i mutanti Specc11 omozigoti.
A maiò parte di l'embrioni mutanti heterozygous o homozygous Specc1lDTM096/RRH048 ùn anu micca sviluppatu dopu à E9.5-10.5 (Figs. 5A-D), è u tubu neurale ùn hà micca chjusu anteriorly (Figs. 5B, D) è qualchì volta chjusu dopu (micca mostratu) ..Stu difettu di chjusu di u tubu neurale craniale era assuciatu cù a maiò parte di CNCC marcatu DLX2 chì restanu in i pieghe neurale à E10.5, chì indicanu nisuna dissezione (Figura 5A'-D').Per determinà se a dimensione generale di CNCC hè stata ancu ridutta, avemu marcatu e linee CNCC cù GFP in e nostre linee di trappule di geni cù Wnt1-Cre è ROSAmTmG.Trasmettimu GFP+ NCC è GFP- (RFP+) non-NCC ordinati da embrioni interi.A E9.5, a proporzione di CNCC marcati da GFP classificate in flussu ùn hà micca cambiatu significativamente trà WT è embrioni mutanti (micca mostrati), chì indicanu a specificazione CNCC normale.Dunque, avemu ipotizatu chì a tintura residuale di Wnt1-Cre è DLX2 in pieghe neurali esposte (Figura 5B ') era dovuta à una stratificazione CNCC difettosa, possibbilmente per una densità aumentata o dispersione di cellule AJ, cum'è vistu in e cellule SPECC1L-kd.Avemu utilizatu i marcatori NCC SOX10, AP2A, è DLX2 per cunfirmà a presenza di CNCC in a piega neurale (Figura 5E-R).À E8.5, a tintura di plega neurale per tutti i trè marcatori NCC hè stata osservata in sezzioni di WT (Fig. 5E, G, I) è Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).À E9.5, mentre chì i marcatori NCC macchiavanu migrating NCC in sezioni WT (Fig. 5M, O, Q), a tintura di NCC residuale hè stata osservata in i plegamenti neurali esposti di Specc1l embrioni mutanti (Fig. 5N, P, R).Perchè SOX10 è DLX2 marcanu CNCC migratori, stu risultatu suggerisce chì i CNCC carenti di SPECC1L ottennu specificazioni post-migratorie, ma ùn riescenu à migrà da i pieghe neurali.
A carenza di Specc11 porta à una chiusura di tubu neurale difettu, delaminazione di e cellule di cresta neurale craniale è AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrione chì porta cellule di cresta neurale craniale in migrazione (CNCC) marcate cù Wnt1-Cre (A').In cuntrastu, l'embrioni mutanti Specc11 mostranu pieghe neurale aperte (B), punte di freccia) è CNCC chì ùn anu micca migratu (B ', punte di freccia).(C, D') Immagini di campo luminoso (C, D') e immunocolorazione (C', D') del marcatore CNCC DLX2 di embrioni E10.5 WT (C, C') e Specc1l (D, D').In embrioni WT E10.5, CNCC DLX2-positivi colonizzanu l'archi branchiali (C', frecce), mentre chì in i mutanti, una colorazione visibile persiste in i pieghe neurali aperte (D', frecce) è in i primi archi faringei (D', frecce). frecce).) cù qualchì tintura (frecce) chì indicanu una mala delaminazione è a migrazione di CNCC.ER) Sezioni di embrioni mutanti WT è Specc1l in fasi E8.5 (E-L) è E9.5 (M-R) sò state marcate cù marcatori NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) è DLX2 (I, J, Q, R).A E8.5, a tintura di NCC hè stata osservata in sezioni neurali di tipu salvaticu (NF) è mutanti.La co-coloration de SOX10 et β-caténine dans E8.5 WT (K) et mutant (L) a révélé une coloration accrue de β-caténine aux limites cellulaires dans les plis neuraux.A E9.5, una colorazione di tipu salvaticu di CNCC migratori (M, O, Q) hè stata osservata, mentre chì in i mutanti, CNCC non stratificati macchiavanu pieghe neurali aperte (N, P, R).(S-Z) Analisi di etichettatura AJ in vivo in sezioni coronali di embrioni WT è Specc11DTM096/RRH048 cù a mutazione E9.5.Un pianu seccionale apprussimativu hè mostratu in l'angulu superiore dirittu.In sezioni di tessuti mutanti, hè stata osservata una colorazione aumentata di F-actina (S, T) è miosina IIb (U, V).Simile à i risultati in vitro in Fig. 3, in l'embrioni mutanti, a tintura di a membrana rinforzata per β-catenina (W, X) è E-cadherin (Y, Z) hè stata osservata.(AA-BB) Una micrografia elettronica di una sezione di un embrione di tipu salvaticu chì guarda oltre u cunfini di a cellula apicale-basale mostra una regione distinta di densa elettronica indicativa di giunzioni adesive (AA, frecce).In cuntrastu, in rùbbriche di embrioni mutanti Specc11 (BB, frecce), tutta a junction apicobasal hè densa di l'elettroni, chì indicanu una densità aumentata è dispersione di junctions adesivi.
Per pruvà a nostra ipotesi chì a stratificazione ridutta hè duvuta à l'AJ alteratu, avemu esaminatu l'etichettatura AJ in i plegamenti neurali esposti di l'embrioni mutanti Specc1l (Fig. 5S-Z).Avemu osservatu un incrementu di fibri di stress actin (Fig. 5S, T) è una localizzazione aumentata concomitante di myosin IIB staining on fibre actin (Fig. 5U, V).Impurtante, avemu osservatu una tintura aumentata di β-catenina (Fig. 5W, X) è E-cadherin (Fig. 5Y, Z) à i cunfini intercellulari.Avemu ancu esaminatu a tintura di β-catenina di NCC in i plegamenti neurali di l'embrioni E8.5 (Fig. 5K, L).A tintura di β-catenina pareva più forte in Specc1l mutant neural folds (Fig. 5L è K), suggerenu chì i cambiamenti AJ avianu cuminciatu.In i micrografii elettroni di e sezioni di craniu di l'embrioni E9.5, avemu dinò osservatu una tintura diffusa di densità di elettroni in l'embrioni mutanti Specc1l cumparatu cù WT (Fig. 5AA, BB è S1E-H).Inseme, questi risultati supportanu i nostri risultati in vitro in cellule SPECC1L-kd U2OS è suggerenu chì una colorazione AJ aberrante precede a stratificazione CNCC in i nostri embrioni mutanti.
Data a relazione antagonista cunnisciuta trà l'attività AKT è a stabilità di E-cadherin, 17,28 avemu ipotizatu l'implicazione di a signalazione PI3K-AKT.In più, avemu osservatu subepidermal blistering in certi di i nostri embrioni mutanti chì scappavanu a letalità (<5%) à E9.5-10.5 è invece si sò stallati à circa E13.5 (Fig. S3).I vesiculi subepidermali sò un segnu di a signalazione PI3K-AKT ridotta basata in PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) hà riportatu chì l'interruzzione di l'attivazione di PI3K basata in PDGFRα in embrioni mutanti PdgfraPI3K/PI3K risulta in vescicole subepidermali, difetti di u tubu neurale è fenotipi di palatoschisi.Infatti, i livelli di pan-AKT è Ser473-AKT fosforilate attivu sò stati ridotti in vivo in tissuti mutanti Specc1l à l'arrestu embrionariu E9.5 (Fig. 6A-D).A diminuzione di i livelli di Ser473-AKT fosforilate pò esse interamente dovutu à a diminuzione di i livelli di pan-AKT in vivo (FIG. 6E) è in vitro (FIG. 6F).Una diminuzione in vitro hè stata osservata solu quandu e cellule U2OS eranu forti cunfluenti cù cambiamenti in a forma di e cellule è a densità AJ (Figura 6D).Cusì, i nostri dati suggerenu chì SPECC1L hè un novu regulatore pusitivu di a signalazione PI3K-AKT in a morfogenesi craniofacial.
(A-E) E8.5 (A, B) è E9.5 (C, D) sezioni di craniu o E9.5 lisati da embrioni mutanti Specc1l (E) chì mostranu livelli di S473-AKT fosforilatu attivu è riduzzione di proteine ​​​​pan-AKT , paragunatu à u cuntrollu WT.Western blotting hè stata realizata nantu à lisati di tipu salvaticu è lisati mutanti in e stesse cundizioni.L'imaghjini mostrati per SPECC1L sò stati pigliati da una macchia.A stessa macchia hè stata eliminata è ri-esaminata cù anticorpi anti-pan-ACT è β-actin.I livelli di Pan-AKT in E8.5 pieghe neurali (A, B) è i livelli di S473-AKT fosforilati in e sezioni di craniu E9.5 sò stati significativamente ridotti.(F) I livelli di Pan-AKT sò stati ridotti in modu simile in lisati di cellule SPECC1L-kd U2OS raccolte à alta confluenza.E barre d'errore rapprisentanu SEM da trè quantificazioni Western blot indipendenti.(GJ) Sezioni di embrioni WT in E9.5 macchiate cù KI67 è caspase 3 scissa, rispettivamente, chì mostranu proliferazione cellulare (G, G') è poca attività apoptotica (H, H').L'embrioni mutanti Specc11 mostranu una proliferazione cellulare comparabile (I), ma u numeru di cellule sottumessi à l'apoptosi hè significativamente aumentatu (J).
Dopu avemu esaminatu i marcatori di proliferazione è apoptosi.Ùn avemu micca osservatu nisuna differenza in a proliferazione di l'embrioni E9.5 (Fig. 6E, G cumparatu cù I) cù un indice di proliferazione di 82.5% per i mutanti WT è 86.5% per i mutanti Specc1l misurati da a tintura KI67 (p <0.56, Fisher's). prova esatta).In listessu modu, ùn avemu micca osservatu alcuna differenza in l'apoptosi misurata da a tintura per a caspase 3 clivata in pieghe neurali à E8.5 finu à l'arrestu di l'embriione (micca mostratu) (micca mostratu).In cuntrastu, l'apoptosi hè stata significativamente aumentata in tutti l'embrioni mutanti E9.5 (Fig. 6F, H è J).Questu aumentu generale di l'apoptosi hè coherente cù a signalazione PI3K-AKT ridotta è a letalità embrionica precoce29,30,31.
In seguitu, per cunfirmà un rolu causale per a signalazione PI3K-AKT in i cambiamenti AJ in e nostre cellule kd, avemu alteratu chimicamente a via in u cuntrollu è e cellule kd (Figura 7A-F).Avemu usatu cum'è marcatore u fenotipu di cambiamentu di a forma di a cellula osservatu in e cellule SPECC1L-kd confluenti, chì avemu quantificatu utilizendu u rapportu di a dimensione più longa (lunghezza) à a dimensione verticale currispondente (larghezza).Un rapportu di 1 hè previstu per e cellule relativamente tondi o cuboidali (Figura 7G).In più di a forma di cellula, avemu ancu cunfirmatu l'effettu nantu à AJ da β-catenin staining (Fig. 7A'-F').L'inibizione di a via PI3K-AKT cù wortmannin era abbastanza per cambià a forma di e cellule in e cellule di cuntrollu (Figura 7A, C) è AJ (Figura 7A ').L'attivatore PI3K-AKT SC-79 ùn hà micca affettatu a forma di cellula (FIG. 7A, E) o l'espansione AJ (FIG. 7A') in i celluli di cuntrollu.In i celluli SPECC1L-kd, più suppressione di a via PI3K-AKT risultatu in l'apoptosi aumentata (Fig. 7B, D) è un incrementu marcatu in β-catenin staining (Fig. 7B '), cunsistenti cù i nostri mutanti pesanti in vivo.Impurtante, l'attivazione di a via PI3K-AKT hà migliuratu significativamente a forma di e cellule (Figura 7B, F) è i fenotipi AJ (Figura 7B").I cambiamenti in a forma di a cellula sò stati quantificati cum'è u rapportu di roundness cellula (CCR) è paragunatu per significatu cum'è descrittu sopra (FIG. 7G).Infatti, in e cellule di cuntrollu (Fig. 7G, CCR = 1.56), u trattamentu di wortmannin era abbastanza per cambià significativamente a forma di a cellula (Fig. 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) in quantu simili à quellu osservatu. in SPECC1L.-kd cells (Fig. 7G, CCR = 3.46).Trattamentu di Wortmannin di e cellule SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3.60, negligible) ùn era micca più significativu di i cells kd senza trattamentu (Fig. 7G, CCR = 3.46, negligible) o di cuntrolli di cuntrollu wortmannin (Fig. 7G)., CCR = 3.46, negligible) affetta in più l'allungamentu di a cellula (7G, CCR = 3.61, negligible).U più impurtante, l'attivatore SC-79 AKT hà restauratu u fenotipu allungatu di e cellule SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Questi risultati cunfirmanu chì SPECC1L regula a signalazione di PI3K-AKT è suggerenu chì una diminuzione moderata di SPECC1L afecta l'aderenza cellulare, mentre chì una forte diminuzione porta à l'apoptosi (Fig. 8).
(A-F') Contrôle (A, C, E) et cellules SPECC1L-kd (B, D, F) traitées avec l'inhibiteur de la voie PI3K-AKT wortmannin (C, D) ou l'activateur SC-79 (E, F) .Celluli cuntrolli micca trattati sò cuboidal (A) cù a tintura cellulare normale β-cat (A'), mentre chì e cellule kd sò allungate (B) cù a tintura β-cat aumentata (B').Après la suppression de la voie PI3K-AKT, les cellules de contrôle se sont allongées (C) avec l'expansion du β-cat (C'), tandis que les cellules kd ont commencé à subir l'apoptose (D), similaire à nos embrions hautement mutés et présentant un β-cat extrêmement amélioré.tintura (D').Après l'activation de la voie PI3K-AKT, les cellules de contrôle sont restées cuboïdales (E) et avaient une coloration β-cat (E') normale, tandis que les cellules kd présentaient une forme cellulaire significativement améliorée (F) et une coloration β-cat (F'), indiquant (G) U gradu di cambiamentu di a forma di a cellula in (AF) hè statu quantificatu cù u rapportu di rotondità cellulare (CCR) di a dimensione più longa (lunghezza) è a dimensione verticale currispundente (larghezza) cù u software MetaMorph.Les cellules SPECC1L-kd non traitées (NT) (CCR = 3.46) étaient significativement plus longues que les cellules de contrôle (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).L'inibizione di Wort di a via PI3K-AKT in e cellule di cuntrollu era abbastanza per causà un allungamentu simili in a forma di a cellula (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).In listessu modu, l'attivazione di AKT da SC-79 in e cellule SPECC1L-kd hà restituitu l'allungamentu di e cellule à i livelli di cuntrollu (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).U trattamentu di Wortmannin di e cellule SPECC1L-kd hà risultatu in l'apoptosi aumentata, ma senza più aumentu di u cambiamentu di a forma di cellula (CCR = 3.60) cumparatu cù kd senza trattamentu (CCR = 3.46, ns) o cellule di cuntrollu di wortmannin (3.61) osservati in .ns = ùn importa micca.+/- Misurazioni SEM per 50 cellule sò mostrate.E differenze statistiche sò state calculate cù u test t di Student.
(A) Rappresentazione schematica di l'inibizione è l'attivazione di a via PI3K-AKT chì risultatu in cambiamenti AJ è salvata, rispettivamente.(B) Mudellu prupostu per a stabilizazione di a proteina AKT da SPECC1L.
I CNCC premigratori necessitanu lisi AJ per separà da e cellule neuroepiteliali di a piega neurale anteriore1,15,32.L'aumentu di a colorazione di i cumpunenti AJ è a perdita di a distribuzione asimmetrica apicale-basale di l'AJ in cellule carenti di SPECC1L sia in vitro sia in vivo, cumminati cù a vicinanza fisica di SPECC1L à β-catenina, suggerenu chì SPECC1L funziona per mantene bè a stabilità locale di AJ per musculi urganisazione.citoscheletro di actina.L'associazione di SPECC1L cù u citoscheletru di actina è β-catenina è l'aumentu di u nùmeru di filamenti d'actina condensati in l'absenza di SPECC1L hè coherente cù l'aumentu osservatu di a densità AJ.Un'altra pussibilità hè chì un nùmeru aumentatu di fibri di actina in e cellule di carenza di SPECC1L porta à un cambiamentu di a tensione intercellulare.Perchè l'estresse cellulare affetta a dinamica AJ 33, i cambiamenti di tensione pò esse risultatu in AJ 34 più diffusa.Allora ogni cambiamentu affetterà i strati CNCC.
Wnt1 hè spressione in i primi folds neurali chì dà origine à e cellule di a cresta neurale.Cusì, a traccia di linea Wnt1-cre marca sia NCC35 pre è migrante.Tuttavia, Wnt1 marca ancu i cloni di tissuti cerebrali dorsali derivati ​​ancu da i primi folds neurali 35,36, facendu prubabile chì a nostra tintura di mutanti E9.5 per i marcatori Wnt1 in pieghe neurale aperte ùn hè micca CNCC.A nostra colorazione positiva per i marcatori NCC AP2A è SOX10 hà cunfirmatu chì i pieghe neurali esposti di l'embrioni mutanti Specc11 cuntenenu veramente CNCC.Inoltre, postu chì AP2A è SOX10 sò marcatori di NCC migratori precoci, a tintura positiva indicava chì queste cellule sò CNCC post-migratori chì ùn ponu micca stratificate da E9.5.
I nostri dati suggerenu chì a regulazione moleculare di AJ da SPECC1L hè mediata da a signalazione PI3K-AKT.A signalazione AKT hè ridutta in cellule è tissuti carenti di SPECC1L.I risultati di Fantauzzo et al.sustene un rolu direttu per a signalazione PI3K-AKT in a morfogenesi craniofacial.(2014) hà dimustratu chì a mancanza d'attivazione di a signalazione PI3K-AKT basata in PDGFRα porta à un fenotipu di palate left.Mostremu ancu chì l'inibizione di a via PI3K-AKT hè abbastanza per cambià AJ è a forma di e cellule in e cellule U2OS.In cunfurmità cù i nostri risultati, Cain et al.37 hà dimustratu chì a downregulation di a subunità PI3K α110 in e cellule endoteliali si traduce in un incrementu simile in a colorazione pericellulare di β-catenina, chjamatu un incrementu di "l'indice di cunnessione".In ogni casu, in e cellule endoteliali chì i filamenti di actina sò digià altamente organizzati, a suppressione di a via PI3K-AKT si traduce in una forma di cellula libera.In cuntrastu, e cellule SPECC1L-kd U2OS mostranu una forma di cellula allungata.Sta differenza pò esse specifica di u tipu di cellula.Mentre a suppressione di a signalazione PI3K-AKT affetta in permanenza u citoscheletru di l'actina, l'effettu nantu à a forma di a cellula hè determinata da cambiamenti di tensione causati da cambiamenti in a densità è l'urganizazione di e fibre d'actina cintrali.In e cellule U2OS, avemu usatu solu i cambiamenti di a forma di e cellule cum'è un marcatore di SPECC1L-deficient AJ cambiamentu è ricuperazione.In cunclusione, ipotisemu chì l'inibizione di a via AKT in a carenza di SPECC1L aumenta a stabilità AJ è riduce a delaminazione in CNCC.
Curiosamente, i livelli di pan-AKT sò stati ridotti in vitro è in vivo in più di i livelli fosforilati di 473-AKT in l'absenza di SPECC1L, chì suggerenu a regulazione di a signalazione PI3K-AKT à u livellu di stabilità di a proteina AKT o turnover.I geni SPECC1L è MID1, tramindui assuciati cù u sindromu Opitz / GBBB, codificanu proteini chì stabilizzanu i microtubuli 18,22.U mecanismu da quale SPECC1L è MID1 mediate l'estabilizazione di i microtubuli ùn hè micca cumplettamente capitu.In u casu di SPECC1L, sta stabilizazione include l'acetylation rinfurzata di un subset di microtubuli 18.Hè pussibule chì SPECC1L usa un mecanismu simili per stabilizzà altre proteini cum'è AKT.Hè statu dimustratu chì l'acetilazione di i residui di lisina in a proteina AKT porta à una diminuzione di a localizazione di a membrana è a fosforilazione38.Inoltre, l'ubiquitinazione di a catena K63 à u listessu residu di lisina nantu à AKT hè necessaria per a so localizazione è attivazione di a membrana39,40.Frà parechji fatturi chì interagiscenu cù e proteine ​​​​SPECC1L identificate in diversi schermi di dui ibridi di lievitu à altu throughput, quattru - CCDC841, ECM2942, APC è UBE2I43 - sò stati implicati in u turnover di proteine ​​​​o stabilità via ubiquitination o sumoylation.SPECC1L pò esse implicatu in a mudificazione post-traduzionale di i residui di lisina AKT, affettendu a stabilità AKT.Tuttavia, u rolu criticu di SPECC1L in a localizazione è a stabilità di a proteina AKT resta à esse elucidatu.
I difetti severi in l'espressione di SPECC1L in vivo anu risultatu in una colorazione aumentata di u marcatore AJ è una superposizione difettuosa di CNCC, è ancu una crescita di l'apoptosi è a letalità embrionale precoce.I rapporti precedenti anu dimustratu chì i mutanti di u mouse cù livelli aumentati di apoptosi sò assuciati cù difetti di u tubu neurale 44,45,46,47 è difetti craniofacial48.Hè statu suggeritu chì a morte eccessiva di e cellule in i piegamenti neurali o archi faringeali pò esse risultatu in un numeru insufficiente di cellule necessarie per u muvimentu morfogeneticu propiu 48,49,50.In cuntrastu, e nostre linee cellulari deficienti SPECC1L cù espressione SPECC1L moderatamente ridotta mostranu solu cambiamenti AJ senza evidenza di morte cellulare aumentata.Tuttavia, l'inibizione chimica di a via PI3K-AKT in queste cellule Kd hà risultatu in una crescita di l'apoptosi.Cusì, una diminuzione moderata di l'espressione o funzione SPECC1L assicura a sopravvivenza cellulare.Questu hè coherente cù l'osservazione chì i rari embrioni mutanti Specc11 chì scappanu di l'arrestu à st.E9.5-forsi a causa di a riduzzione di l'efficienza di cattura di geni-sò capaci di chjude i so tubi neurali è si fermanu più tardi in u sviluppu, spessu cù difetti craniofacial (Fig. S3).Hè ancu coherente cù questu hè l'occurrence rara di embrioni Specc1l eterozigoti cù anormalità craniofacial-probabilmente per via di l'aumentu di l'efficienza di cattura di geni - è ancu di a scuperta in zebrafish in quale unu di i dui orthologues SPECC1L (specc1lb) provoca fenotipi embrionali tardivi, cumprese a perdita di mascelle inferiori e fessure bilaterali51.Cusì, mutazioni di perdita di funzione SPECC1L eterozigote identificate in i pazienti umani ponu causà picculi disfunzioni in a funzione SPECC1L durante a morfogenesi craniofacial, abbastanza per spiegà i so clefts orofaciali.A regulazione basata in SPECC1L di i cuntatti intercellulari pò ancu ghjucà un rolu in a palatogenesi è a fusione di l'archi faringei.Ulteriori studii di a funzione SPECC1L aiutanu à elucidare u rolu di i cuntatti intercellulari tempurane in CNCC durante a chjusa di u tubu neurale in a motilità di e cellule neuroepiteliali è a morfogenesi craniofacial.
U cuntrollu di l'osteosarcoma U2OS è e cellule SPECC1L-kd sò state descritte prima (Saadi et al., 2011).L'anticorpi contr'à SPECC1L sò ancu stati carattarizati prima (Saadi et al., 2011).Anticorpi anti-β-catenina (coniglio; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mouse; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miosina IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis). ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego) , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), caspase 3 scissionata (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) è β-actina (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) hè stata utilizata cum'è descritta..I filamenti di actina sò stati macchiati cù Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
E cellule di cuntrollu U2OS è e cellule SPECC1L-kd sò state cultivate in DMEM standard high glucose supplementatu cù 10% di serum bovinu fetale (Life Technologies, Carlsbad, CA).Per i cambiamenti di AJ, 2 x 105 cells sò stati suminati nantu à vetru trattatu cù 0,1% di gelatina porcina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) è osservatu per i cambiamenti in a forma di cellula.I celluli sò stati cullati in diversi punti di tempu indicati: 4 ore dopu à a sementa (t = 1), 24 ore dopu à a sementa (t = 2), cunfluenza senza cambià in a forma di a cellula (t = 3), u cambiamentu in a forma di a cellula (t = 4). , 24 h dopu u cambiamentu di a forma di cellula (t = 5) è 48 h dopu u cambiamentu di a forma di a cellula (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Per modulà a via PI3K-AKT, e cellule sò state cultivate à e cuncentrazioni indicate cù l'inhibitore PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) o attivatore SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).U mediu chì cuntene i sustanzi chimichi hè cambiatu ogni ghjornu.
E registrazioni frame-by-frame sò state fatte nantu à u cuntrollu live è e cellule KD in cundizioni normali di cultura, è l'imaghjini di cuntrastu di fasi sò stati cullati ogni 10 minuti per 7 ghjorni.L'imaghjini sò stati acquistati utilizendu un microscopiu invertitu Leica DM IRB cuntrullatu da l'urdinatore equipatu di un palcuscenicu meccanicu è un scopu 10 × N-PLAN cunnessu à una camera QImaging Retiga-SRV.Duranti l'imaghjini, i culturi di cellule sò stati mantinuti à 37 ° C in una atmosfera umida cù 5% CO2.
Dui linee di cellule ES trap gene DTM096 è RRH048 da u Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) sò state aduprate per generà linee di mouse deficienti Specc11, designate Specc1lgtDTM096 è Specc1lgtRRH046.In breve, e cellule 129/REJ ES sò state iniettate in blastocisti C57BL6.I topi maschi chimerici risultanti sò stati allevati cù topi C57BL6 femminili per identificà a prole cù a colorazione di u mantellu agouti.A prisenza di inserti di vettori di trappule di geni hè stata aduprata per identificà eterozigoti.I topi sò stati guardati nantu à un fondo mistu di 129/REJ; C57BL6.U locu di u situ di inserimentu di u vettore trappula genetica hè stata cunfirmata da RT-PCR, sequenza di genoma è cumplementazione genetica (Figura Supplementaria 1).Per traccia u lignamentu CNCC di topi Specc1lGT doppiu eterozigoti, i topi ROSAmTmG (# 007576) è Wnt1-Cre (# 003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) sò stati attraversati per pruduce l'allele ROSAmTmG è Wnt1-Cre in Speccryos mutante.Tutti l'esperimenti in i topi sò stati realizati secondu i protokolli appruvati da u Cumitatu Istituzionale di Cura è Uso di l'Animali di l'Università di Kansas Medical Center.
L'embrioni sò stati fissati in (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) per 60 min à a temperatura di l'ambienti.Dopu a fissazione in una soluzione di colorazione X-gal (5 mM ferricianuro di potassiu, 5 mM di ferrocianuro di potassio, 2 mM MgCl2, 0,01% deoxycholate di sodiu, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) U sviluppu di macchia hè stata realizata à 37 ° C. .° C in 1-6 ore.L'embrioni sò stati post-fissati in 4% PFA è visualizati.
Per Western blotting, i celluli sò stati lisi in buffer di lisi passiva (Promega, Fitchburg, WI) supplementatu cù una mistura di inhibitori di proteasi HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).I lisati sò stati processati nantu à 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX ready-made gels (Bio-Rad, Hercules, CA) è trasferitu à membrani Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).I membrani sò stati bluccati in 5% latte in PBS chì cuntene 0.1% Tween.L'anticorpi sò stati incubati durante a notte à 4 ° C o per una ora à a temperatura di l'ambienti.U reattivu Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) hè statu utilizatu per a generazione di signali.Per l'immunostaining, l'embrioni sò stati fissi durante a notte in 4% PFA / PBS è criopreservati.I criosezioni di tissuti sò stati bluccati in PBS chì cuntenenu 1% serum di capra normale (Thermo Scientific, Waltham, MA) è 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) è poi incubati à 4 ° C in una incubatrice durante u notte.cù anti-anticorpu è anticorpu secundariu fluorescente (1: 1000) per 1 ora à 4 ° C.E sezioni macchiate sò state piazzate in un mediu d'oru ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) è l'imaghjini piatte sò stati ottenuti cù un microscopiu confocal Leica TCS SPE.Ogni immunostaining hè statu realizatu cum'è trè esperimenti indipendenti nantu à cirossezioni di almenu dui embrioni mutanti.Un esperimentu rappresentativu hè mostratu.
E cellule sò state incubate in buffer RIPA modificatu (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glicerol, 2 mM EDTA, è inhibitore di proteasi HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) In breve, i lisati sò stati prepurificati cù perle magnetiche di proteina G (Life Technologies, Carlsbad, CA) è poi incubate durante a notte à 4 ° C. cù perle di proteina G anti-SPECC1L o IgG sò state usate per estrattà SPECC1L è Western blotting hè stata fatta cù l'anti -β-catenin anticorpu descritti sopra L'esperimenti co-IP mostrati sò rapprisentanti di quattru esperimenti indipendenti.
Cellule cultivate fissi o tessuti embrionali di u mouse sò stati furniti à u centru di microscopia elettronica in u Centru Medicu di l'Università di Kansas.In breve, i campioni sò stati incrustati in resina EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerizati durante a notte à 60 ° C, è sezionati à 80 nm cù un ultramicrotomo Leica UC7 equipatu di una lama di diamante.E sezioni sò state visualizate cù un microscopiu elettronicu di trasmissione JEOL JEM-1400 equipatu cù una pistola Lab6 100 kV.
Cumu cita stu articulu: Wilson, NR et al.A carenza di SPECC1L porta à una stabilità aumentata di e articulazioni spliced ​​è una delaminazione ridotta di e cellule di cresta neurale craniale.a scienza.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induzione è differenziazione di a cresta neurale.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Cellule di a cresta neurale craniale in muvimentu: u so rolu in u sviluppu craniofacial.Revista Americana di Genetica Medica.Part A 155A, 270-279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: a so crescita è u sviluppu più di 20 anni.Pediatra.patologia.laboratoriu.midicina.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU è Noten MM Breakthrough in a genetica di clefts orofaciali.Trends in Molecular Medicine 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. è Riley, FM Meccanismi moleculari di a migrazione di e cellule di a cresta neurale craniale è u mudellu durante u sviluppu craniofacial.Sviluppu 137, 2605-2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH è Murray, JK Cleft lip and palade: capisce l'influenzi genetichi è ambientali.cumentu naturali.Genetica 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Morfogenesi anormali di a pelle, i membri è a regione craniofacial in i topi deficienti di fattore-6 (Irf6) di regulazione di interferone.Genette naziunale.38, 1335-1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Mutazioni dominanti in GRHL3 causanu u sindromu di van der Waord è impediscenu u sviluppu di u peridermu orale.Am J Hum Genet 94, 23-32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ è Juriloff, DM Aghjurnate a lista di i mutanti di i mouse cù difetti in a chiusura di u tubu neurale è u prugressu versu una cunniscenza genetica cumpleta di a chiusura di u tubu neurale.Investigazione di difetti di nascita.Part A, Teratologia Clinica è Molecular 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through a p53-dependent intracellular pathway.Gene Development 28, 1005-1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND è Murdoch, JN Disheveled: Relazione di espansione convergente à a chiusura di u tubu neurale.Tendenze in neurologia.26, 453-455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).