347 12.7 * 1.24mm Tubi spiralati in acciaio inossidabile, Meccanismo moleculare di condensazione elettrostatica sincrona è coaggregazione di α-sinucleina è tau

Grazie per visità Nature.com.Aduprate una versione di navigatore cù supportu CSS limitatu.Per a megliu sperienza, ricumandemu chì utilizate un navigatore aghjurnatu (o disattivà u Modu di Compatibilità in Internet Explorer).Inoltre, per assicurà un supportu continuu, mostramu u situ senza stili è JavaScript.
Sliders chì mostranu trè articuli per slide.Aduprate i buttuni di u ritornu è u prossimu per passà per e diapositive, o i buttoni di u controller di slide à a fine per passà per ogni slide.

347 Specificazione di Pipe in Acciaio Inox

347 12.7 * 1.24mm Tubi spiralati in acciaio inox

Diametru Esternu: 6.00 mm OD finu à 914.4 mm OD, Taglie finu à 24 "NB dispunibule Ex-stock, OD Size Tubi d'acciaio dispunibili Ex-stock

Gamma di spessore di tubi SS 347: 0,3 mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0.5-12mm) O taglia micca regulare per esse adattatu cum'è necessariu

Tipu: SS 347 Tubi senza saldatura |Tubi SS 347 ERW |SS 347 Tubi Saldati |SS 347 Tubi fabbricati |Tubi SS 347 CDW, tubi LSAW / saldati a cucitura / ridisegnati

Forma: SS 347 Tubi/Tubi tondi, SS 347 Tubi/Tubi quadrati, SS 347 Tubi/tubi rettangolari, SS 347 Tubi a spirale, SS 347 Forma a "U", SS 347 Bobine per torte, SS 347 Tubi idraulici

Lunghezza: Singulu Casuale, Doppiu Casuale è Lunghezza Necessaria Estremità: Fine Liscia, Fine Bisellata, Treaded

Prutezzione End: Caps Plastica |Finitura esterna: 2B, No.4, No.1, No.8 Finitura à specchiu per tubi d'acciaio inossidabile, Finitura cum'è i Requisiti di u cliente

Cundizione di consegna: Ricotta è marinata, Lucidata, Ricotta Brillante, Trafilata à Freddu

Ispezione, rapporti di prova: certificati di prova di mulinu, EN 10204 3.1, rapporti chimichi, rapporti meccanici, rapporti di prova PMI, rapporti di ispezione visuale, rapporti d'ispezione di terze parti, rapporti di laboratori approvati da NABL, rapporti di prova distruttivi, rapporti di prova non distruttivi

Imballaggio: Imballatu in scatuli di legnu, sacchetti di plastica, strisce d'acciaio in bundle, o secondu e richieste di i clienti

Speciali: Taglie è Specificazioni diverse da quì sopra ponu esse fabbricate nantu à dumanda

Gamma di dimensioni di tubi SS 347: 1/2 inch NB, OD à 24 inch

ASTM A312 347: Pipa austenitica saldata senza saldatura è a cucitura dritta destinata à alta temperatura è serviziu corrosiu generale.U metallu di riempimentu ùn hè micca permessu durante a saldatura.

ASTM A358 347: Pipa austenitica saldata à fusione elettrica per u serviziu corrosiu è / o à alta temperatura.Di solitu solu pipa finu à 8 inch hè prodotta à sta specificazione.L'aggiunta di metalli di riempimentu hè permessa durante a saldatura.

ASTM A790 347: Pipa ferritica / austenitica (duplex) saldata senza saldatura è dritta destinata à u serviziu di corrosione generale, cun un enfasi particulari nantu à a resistenza à u cracking di corrosione di stress.

ASTM A409 347: Tubi di muru luminoso austeniticu di grande diametru saldatu à fusione elettrica à cucitura dritta o spirale in dimensioni da 14" à 30" cù pareti Sch5S è Sch 10S per corrusione è / o alta

ASTM A376 347: Pipa austenitica senza saldatura per applicazioni à alta temperatura.

ASTM A813 347: Pipa austenitica a cucitura unica, unica o doppia saldata per l'alta temperatura è l'applicazioni corrosive generale.

ASTM A814 347: Pipa austenitica saldata à freddo per alta temperatura è serviziu corrosiu generale.

Composizione chimica di tubi in acciaio inox 347H

Pruprietà meccanica di tubi in acciaio inox 347H

Proprietà fisiche di i tubi in acciaio inox 347H

Gradi Equivalenti per Pipe in Acciaio Inox 347H

L'aggregazione di alfa-sinucleina amiloide (αS) hè un segnu di a malatia di Parkinson è di altre sinucleinopatie.Recentemente, a proteina tau cumunimenti assuciata à a malatia di Alzheimer hè stata assuciata à a patologia αS è truvata per co-localize in inclusioni ricche di αS, ancu s'è u meccanismo moleculare di coaggregazione di e duie proteini resta micca chjaru.Riportemu quì chì a fase αS si separa in condensati liquidi via cundensazione cumplessu elettrostatica cù polipeptidi caricati positivamente cum'è tau.Sicondu l'affinità di αS per i policationi è a rata di deplezione di valenza di a reta di coagulazione, i coaguli sò sottumessi à una rapida gelificazione o coalescenza seguita da una lenta aggregazione amiloide.Cumminendu una suite di tecniche biofisiche avanzate, avemu statu capace di caratterizà a separazione di fase αS/Tau liquidu-liquidu è identificà i fatturi chjave chì portanu à a furmazione di aggregati eterogenei chì cuntenenu e duie proteine ​​​​in un condensatu di proteina liquida.
In più di i compartimenti di a membrana, a separazione spaziale in e cellule pò ancu esse ottenuta da a furmazione di corpi densi ricchi di proteine ​​​​è liquidi chjamati condensati biomoleculari o gocce, attraversu un prucessu cunnisciutu cum'è separazione di fase liquid-liquid (LLPS).Sti gocce sò furmati da interazzione tempurale multivalente, di solitu trà proteini o proteini è RNA, è serve una varietà di funzioni in quasi tutti i sistemi viventi.Un gran numaru di proteini capaci di LLP mostranu sequenze di bassa cumplessità chì sò assai disordinati in natura è in a furmazione di condensati biomoleculari3,4,5.Numerosi studii sperimentali anu revelatu a natura flexible, spessu disordinata è multivalente di e proteine ​​​​chì custituiscenu questi condensati liquidi, ancu s'è pocu hè cunnisciutu di i determinanti molecolari specifichi chì cuntrollanu a crescita è a maturazione di questi condensati à una forma più solida. statu..
I novi dati sustenenu l'ipotesi chì a LLPS aberrante guidata da a proteina è a trasfurmazioni di gocce in strutture solide ponu esse percorsi cellulari pertinenti chì portanu à a furmazione di aggregati tossichi insolubili chì sò spessu segni distintivi di e malatie degenerative.Parechje proteine ​​​​intrinsecamente disordinate (IDP) assuciate à LLPS, spessu cariche è flessibili, sò longu assuciate cù a neurodegenerazione attraversu u prucessu di aggregazione amiloide.In particulare, i condensati IDP biomoleculari cum'è FUS7 o TDP-438 o proteini cù grandi duminii di cumplessità bassu cum'è hnRNPA19 sò stati dimustrati per età in forme gel-like o ancu solidi per un prucessu chjamatu fluidizazione.compostu.à a transizione in fase solida (LSPT) in funzione di u tempu o in risposta à certe mudificazioni post-traduzzione o mutazioni patologicamente significative1,7.
Un altru IDP assuciatu à LLPS in vivo hè Tau, una proteina disordinata associata à i microtubuli chì a so aggregazione amiloide hè stata implicata in a malatia di Alzheimer10 ma hè stata ancu implicata recentemente in a malatia di Parkinson (PD) è altre proteinopatie nucleari sinaptiche 11, 12, 13 sò legate.Tau hè statu dimustratu chì si dissocia spontaneamente da a suluzione / citoplasma per via di interazzioni elettrostatiche favurevuli14, risultatu in a furmazione di gocce arricchite di tau cunnisciute cum'è coacervati elettrostatici.Hè statu ancu osservatu chì stu tipu d'interazzione non-specifica hè a forza motrice di parechji condensati biomoleculari in natura15.In u casu di una proteina tau, l'agregazione elettrostatica pò esse formata da aggregazione simplice, in quale e regioni caricate opposte di a proteina attivanu u prucessu di scissione, o da aggregazione cumplessa per interazzione cù polimeri caricati negativamente cum'è RNA.
Recentemente, l'α-synuclein (αS), un IDP amiloide implicatu in PD è altre malatie neurodegenerative cunnisciute cullettivamente cum'è sinucleinopatia17,18, hè statu dimustratu in mudelli cellulari è animali19,20 cuncentrati in condensati di prutezione cù un cumpurtamentu fluidu.Studi in vitro hanno dimostrato che l'αS subisce LLPS per semplice aggregazione attraverso interazioni prevalentemente idrofobiche, anche se questo processo richiede concentrazioni di proteine ​​eccezionalmente elevate e tempi di incubazione atipici lunghi19,21.Sia chì i condensati chì cuntenenu αS osservati in vivo sò furmati da questu o altri prucessi LLPS resta un prublema chjave senza risolve.In u listessu modu, ancu se l'agregazione amiloide αS hè stata osservata in i neuroni in PD è altre sinucleinopatie, u mecanismu esattu da quale αS subisce l'aggregazione amiloide intracellulare ùn hè micca chjaru, postu chì l'overespressione di sta proteina ùn pare micca attivà stu prucessu da sè stessu.Un dannu cellulare supplementu hè spessu necessariu, chì suggerenu chì certi lochi cellulari o microambienti sò necessarii per a renucleazione di assemblee amiloidi αS intracellulari.Un ambiente cellulare chì hè particularmente propensu à l'agregazione pò esse l'internu di i condensati di prutezione 23 .
Curiosamente, αS è tau sò stati trovati per co-localize in inclusi di malatie caratteristiche in l'omu cù a malatia di Parkinson è altre sinucleinopatie 24,25 è l'esperimenti anu riportatu una relazione patologica sinergica trà e duie proteine ​​26,27 chì suggerenu una relazione potenziale trà l'agregazione αS è tau in e malatie neurodegenerative.malatia.αS è tau sò stati truvati per interagisce è prumove l'agregazione di l'altri in vitro è in vivo 28,29 è aggregati eterogenei cumposti da sti dui proteini sò stati osservati in u cervellu di i malati cù sinucleinopatie 30 .Tuttavia, pocu hè cunnisciutu di a basa moleculare di l'interazzione trà αS è tau è u meccanismo di a so co-aggregazione.L'αS hè statu rapportatu per interagisce cù tau attraversu una attrazione elettrostatica trà a regione C-terminale altamente carica negativamente di αS è a regione centrale ricca in prolina di tau, chì hè ancu arricchita in residui caricati positivamente.
In questu studiu, dimustramu chì αS pò dissociate in gocce per via di a cundensazione di cumplessu elettrostaticu in a presenza di a proteina tau, in cuntrastu cù a so interazzione cù altri polipeptidi caricati positivamente cum'è a poli-L-lisina (pLK), è in questu prucessu.L'αS agit comme une molécule d'échafaudage pour le réseau de gouttelettes.Avemu identificatu differenzi notevuli in u prucessu di maturazione di i coacervati αS elettrostatici, chì sò assuciati cù differenzi in a valenza è a forza di l'interazzione di e proteine ​​​​implicate in a reta di coacervate.Curiosamente, avemu osservatu a co-aggregazione di proteine ​​​​amiloide αS è tau in coacervati liquidi di longa vita è identificatu alcuni fatturi chjave chì portanu à a co-aggregazione di sti dui proteini in tali coacervati.Quì descrivemu in dettagliu stu prucessu, chì hè un pussibule mecanismu moleculare sottu à a colocalizazione di duie proteine ​​​​in inclusioni specifiche di a malatia.
αS hà una cuda C-terminale assai anionica à u pH neutru (Fig. 1a), è avemu ipotisatu chì puderia esse sottumessi à LLPS per a cundensazione di complexi elettrostatici cù molécule polipeptidiche disordinate polycationic.Avemu usatu una poly-L-lysine di 100 residui (pLK) cum'è a molècula di mudellu di partenza per via di a so natura polimerica carica positiva è disordinata à pH neutru 32. Prima, avemu cunfirmatu chì pLK interagisce cù u duminiu Ct di αS via spettroscopia di Soluzione NMR. (Figura 1b) utilizendu αS marcatu 13C / 15N in presenza di αS: pLK rapporti molari crescenti.L'interazzione di pLK cù u duminiu Ct di αS si manifesta in perturbazioni di u cambiamentu chimicu è una diminuzione di l'intensità di punta in questa regione di a proteina.Curiosamente, quandu avemu mischjatu αS cù pLK à una cuncentrazione αS di circa.5-25 µM in presenza di polietilenglicol (5-15% PEG-8) (buffer LLPS tipicu: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) avemu immediatamente attraversatu un vastu campu di furmazione di proteine. .gocce sò stati osservati cù fluoriscenza (WF) è luminosu-campu (BF) microscopia (Fig. 1c).Goccette di 1-5 µm contenenti αS concentrato (aggiunta 1 µM di αS etichettato AlexaFluor488, AF488-αS), e loro proprietà elettrostatiche possono essere derivate dalla loro resistenza al 10% di 1,6-hexanediol (1,6-HD) e dalla sua sensibilità a un aumentu di a cuncentrazione di NaCl (Fig. 1c).A natura fluida di i coacervati di u cumplessu elettrostaticu αS / pLK hè dimustratu da a so capacità di fusione in millisecondi (Fig. 1d).Utilizendu a turbidimetria, avemu quantificatu a furmazione di gocce in queste cundizioni, cunfirmatu a natura elettrostatica di l'interazzione principale assuciata cù a so stabilità (Fig. 1e), è evaluate l'effettu di parechji rapporti di polimeru nantu à u prucessu LLPS (Fig. 1f).Ancu se a furmazione di gocce hè osservata nantu à una larga gamma di rapporti di polimeru, u prucessu hè assai favurevule quandu pLK hè in più di αS.LLP sò stati ancu osservati utilizendu l'agenti di spostamenti chimicamente differenti dextran-70 (70 kDa) o cù una varietà di formati di mostra, cumprese gocce di vetru di vetru, pozzi di micropiatti di vari materiali, Eppendorf o capillari di quartz.
una Rappresentazione schematica di diverse regioni di proteine ​​​​in i varianti WT-αS è ΔCt-αS utilizati in stu studiu.U duminiu N-terminale anfipaticu, a regione idrofobica di formazione di amiloide (NAC) è u duminiu C-terminale caricatu negativamente sò mostrati in blu, aranciu è rossu, rispettivamente.A mappa Net Charge Per Residual (NCPR) di WT-αS hè mostrata.b Analisi NMR di l'interazione αS/pLK in assenza di grumi macromolecolari.Quandu a concentrazione pLK aumenta (αS: pLK ratios molar di 1: 0.5, 1: 1.5 è 1: 10 sò mostrati in verde chjaru, verde è verde scuru, rispettivamente).c Coacervare αS/pLK (rapporto molare 1:10) a 25 µM (1 µM AF488-etichettato αS o Atto647N-etichettato pLK per l'imaging WF) in tampone LLPS (in alto) o supplementato con 500 mM NaCl (in basso a sinistra) o dopo 110 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; in basso à destra).Barre d'échelle = 20 µm.d Imaghjini microscòpichi rapprisentanti di a fusione di gocce BF di αS/pLK (rapportu molare 1:10) à una cuncentrazione di 25 μM;frecce indicanu a fusione di gocce individuali (frecce rosse è gialle) in una nova goccia (freccia aranciu) in 200 ms).Barre d'échelle = 20 µm.e Diffusione di luce (à 350 nm) Aggregazione αS/pLK in tampone LLPS prima e dopo l'aggiunta di 500 mM NaCl o 10% 1,6-HD à 25 µM αS (N = 3 replicati di campioni, deviazione media e standard indicata anche).f Image BF (in cima) è analisi di scattering di luce (à 350 nm, in fondu) di l'aggregazione αS/pLK à 25 μM αS cù u rapportu molare αS:pLK crescente (N = 3 replicati di campioni, deviazione media è standard ancu indicata).Barre d'échelle = 10 µm.A barra di scala nantu à una maghjina indica a scala di tutte l'imaghjini in un pannellu.I dati crudi sò furniti in forma di schedarii di dati crudi.
Basatu nantu à e nostre osservazioni di a condensazione di u complexu elettrostaticu αS/pLK è l'osservazioni precedenti di αS cum'è una molecula cliente di u condensatu tau/RNA attraversu l'interazione diretta cù tau31, avemu ipotizatu chì αS è tau puderanu co-segregate cù u solvente in assenza di RNA. cundensazione.attraverso complessi elettrostatici, e αS è la proteina scaffold nei coacervati αS/Tau (vedi distribuzione di carica tau in Figura 2e).Avemu osservatu chì quandu 10 μM αS è 10 μM Tau441 (contenente 1 μM AF488-αS e 1 μM Atto647N-Tau, rispettivamente) sò stati mischiati in un buffer LLPS, formavanu facilmente aggregati di proteine ​​​​contenenti entrambe e proteine, cum'è vistu da a microscopia WF.(Fig. 2a).A colocalizazione di e duie proteine ​​​​in i gocce hè stata cunfirmata da a microscopia confocal (CF) (Figura supplementaria 1a).Cumportamentu simili hè statu osservatu quandu dextran-70 hè stata utilizata com'è agentu di aggregazione (Figura Supplementaria 1c).Utilizendu o PEG marcatu FITC o dextran, avemu trovu chì i dui agenti d'affullamentu sò stati distribuiti uniformemente in i campioni, chì ùn mostranu nè segregazione nè associazione (Figura supplementaria 1d).Piuttostu, suggerisce chì in questu sistema prumove a separazione di fasi per via di l'effetti di affollamentu macromoleculare, postu chì PEG hè un agentu di affullamentu preferenzialmente stabile, cum'è vistu in altri sistemi LLP33,34.Queste gocce ricche di proteini eranu sensibili à NaCl (1 M) ma micca à 1,6-HD (10% v / v), cunfirmendu e so proprietà elettrostatiche (Figura Supplementaria 2a, b).U so cumpurtamentu fluidu hè statu cunfirmatu da l'osservazione di l'avvenimenti di gocce di fusione di millisecondi cù a microscopia BF (Fig. 2b).
a Confocal (CF) microscopy images of αS/Tau441 coacervates in LLPS buffer (10 μM of each protein, 0.5 μM of AF488-labeled αS and Atto647N-labeled Tau441).b Immagini di cuntrastu di interferenza differenziale rappresentativa (DIC) di eventi di fusione di gocce αS/Tau441 (10 μM per ogni proteina).c Diagramma di fase basato sulla diffusione della luce (a 350 nm) di Tau441 LLPS (0–15 µM) in assenza (a sinistra) o presenza (a destra) di 50 µM αS.I culori più caldi indicanu più scattering.d Diffusione di luce di campioni αS/Tau441 LLPS cù una concentrazione crescente di αS (Tau441 à 5 µM, N = 2-3 ripetizioni di campionu cum'è indicatu).e Rappresentazione schematica di alcune varianti di a proteina tau è e diverse regioni di a proteina aduprata in stu studiu: duminiu N-terminale caricatu negativamente (rossu), regione ricca di proline (blu), domini di legame à i microtubuli (MTBD, evidenziatu in aranciu), è spirale di coppia formatrice di amiloide.regioni di filamenti (PHF) situate in u MTBD (grigiu).A mappa Net Charge Per Residue (NCPR) di Tau441 hè mostrata.f Utilizzando αS marcato con AF488 1 µM e ΔNt- marcato con Atto647N, utilizzando αS o ΔCt-αS marcato con AF488 1 µM in presenza di ΔNt-Tau (in alto, 10 µM per proteina) o K18 (in basso, µM per proteina) ) ) ) micrografie di WF condensate in LLPS o buffer K18.E barre di scala in una maghjina rapprisentanu a scala di tutte l'imaghjini in un pannellu (20 µm per i pannelli a, b è f).I dati crudi per i pannelli c è d sò furniti cum'è schedarii di dati crudi.
Per pruvà u rolu di αS in stu prucessu LLPS, avemu prima investigatu l'effettu di αS nantu à a stabilità di a goccia per nefelometria utilizendu cuncentrazione crescente di NaCl (Fig. 2c).A più alta hè a cuncentrazione di sali in i campioni chì cuntenenu αS, più altu sò i valori di scattering di luce (à 350 nm), chì indicanu u rolu stabilizzante di αS in stu sistema LLPS.Un effettu simile pò esse osservatu aumentandu a cuncentrazione di αS (è dunque u rapportu αS:Tau441) à circa.Aumentu di 10 volte relative à a cuncentrazione di tau (5 µM) (Fig. 2d).Per dimustrà chì αS hè una proteina di scaffold in coacervates, avemu decisu di investigà u cumpurtamentu di u mutante Tau disrupted da LLPS, chì ùn manca una regione N-terminale caricata negativamente (residues 1-150, vede Fig. 2e) chjamatu ΔNt-Tau.A microscopia WF è a nefelometria cunfirmava chì ΔNt-Tau stessu ùn hà micca sottumessu LLPS (Fig. 2f è Supplementary Fig. 2d), cum'è l'annunziu prima 14. In ogni modu, quandu αS hè stata aghjunta à suluzione di dispersione di sta variante Tau truncata, u prucessu LLPS hè stata cumpletamente. ristabilita cù a densità di goccia vicinu à a densità di goccia di suluzione full-size di Tau è αS in cundizioni simili è cuncentrazioni di prutezione.Stu prucessu pò ancu esse osservatu in cundizioni di massa macromolecular bassa (Figura Supplementaria 2c).U rolu di a regione αS C-terminale, ma micca tutta a so lunghezza, in u prucessu LLPS hè statu dimustratu da l'inhibizione di a furmazione di gocce cù una variante αS troncata C-terminale mancante di residui 104-140 (Fig. 1a) di u (ΔCt-). αS) proteina (Fig. 2f è Supplementary Fig. 2d).A colocalizazione di αS è ΔNt-Tau hè stata cunfirmata da a microscopia di fluorescenza confocale (Figura supplementaria 1b).
Per pruvà ulteriormente u mecanismu LLPS trà Tau441 è αS, hè stata aduprata una variante Tau addiziale, vale à dì u frammentu di core di filamento elicoidale accoppiatu (PHF) in u duminiu di i microtubuli-binding (MTBD), chì s'ellu cuntene quattru duminii ripetitivi caratteristici, cumunimenti ancu cunnisciuti. cum'è u frammentu K18 (vede Fig. 2e).Recentemente hè statu infurmatu chì l'αS si lega preferenzialmente à una proteina tau situata in un duminiu riccu di proline in una sequenza chì precede u duminiu di i microtubuli.Tuttavia, a regione PHF hè ancu ricca di residui di carica positivamente (vede a Figura 2e), in particulare di lisina (15% di residui), chì ci hà incitatu à pruvà se sta regione cuntribuisce ancu à a condensazione di u cumplessu αS/Tau.Avemu osservatu chì K18 solu ùn puderia micca attivà LLPS à cuncentrazioni finu à 100 μM in e cundizioni testate (tampon LLPS cù 15% PEG o 20% dextran) (Figura 2f).In ogni casu, quandu avemu aghjustatu 50 µM αS à 50 µM K18, a furmazione rapida di gocce di proteina chì cuntenenu K18 è αS hè stata osservata da nefelometria (Figura supplementaria 2d) è microscopia WF (Fig. 2f).Cum'è l'aspittava, ΔCt-αS ùn era micca capaci di restaurà u cumpurtamentu LLPS di K18 (Fig. 2f).Si noti che l'aggregazione αS/K18 richiede concentrazioni di proteine ​​leggermente più elevate per indurre LLPS rispetto a αS/ΔNt-Tau o αS/Tau441, altre cose uguali.Questu hè coherente cù una interazzione più forte di a regione C-terminale αS cù u duminiu Tau riccu in proline cumparatu cù u duminiu di i microtubuli, cum'è descrittu prima 31 .
Siccomu ΔNt-Tau ùn pò micca eseguisce LLPS in assenza di αS, avemu sceltu questa variante Tau cum'è mudellu per caratterizà αS/Tau LLPS data a so simplicità in sistemi LLPS cù Tau full-length (isotipu, Tau441/Tau441).cù prucessi di aggregazione cumplessi (eterotipichi, αS/Tau441).Avemu paragunatu u gradu di aggregazione αS (cum'è parte di a proteina di fase condensata, fαS,c) in i sistemi αS/Tau è αS/ΔNt-Tau per centrifugazione è analisi SDS-PAGE in fase dispersa (vede 2e), truvamu valori assai simili. per tutte e proteine ​​​​a listessa cuncentrazione.In particolare, abbiamo ottenuto fαS,c 84 ± 2% e 79 ± 7% per αS/Tau e αS/ΔNt-Tau, rispettivamente, suggerendo che l'interazione eterotipica tra αS e tau è superiore all'interazione tra molecole tau.trà.
L'interazzione cù diversi policationi è l'effettu di u prucessu di condensazione nantu à a cinetica αS sò stati studiati prima da u metudu di ricuperazione di fluorescenza dopu à photobleaching (FRAP).Abbiamo testato i coacervati αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau e αS/pLK (100 μM αS supplementati con 2 μM αS AF488-αS e 100 μM Tau441 o ΔNt-Tau o 1 mM pLK).I dati sò stati ottenuti in i primi 30 minuti dopu à mischjà i cumpunenti di mostra.Da l'imaghjini rapprisentanti FRAP (Fig. 3a, αS / Tau441 condensazione) è e so curve di u cursu di u tempu currispundenti (Fig. 3b, Supplementary Fig. 3), si pò vede chì a cinetica αS sò assai simili à quelli di i coacervati Tau441.è ΔNt-Tau, chì hè assai più veloce cù pLK.Les coefficients de diffusion calculés pour αS à l'intérieur du coacervat selon FRAP (comme décrit par Kang et al. 35) sont D = 0,013 ± 0,009 µm2/s et D = 0,026 ± 0,008 µm2/s pour αS/Tau441 et αNt-S pour/Δ u sistema αS/.pLK, Tau è D = 0.18 ± 0.04 µm2 / s, rispettivamente (Fig. 3c).Tuttavia, u coefficiente di diffusione αS in a fase dispersa hè parechji ordini di grandezza più altu ch'è tutte e fasi condensate, cum'è determinatu da a Spectroscopia di Correlazione di Fluorescenza (FCS, vede Supplementary Fig. 3) in e stesse cundizioni (buffer LLPS) ma in assenza di polication. (D = 8 ± 4 µm2/s).Dunque, a cinetica di a traduzzione αS hè significativamente ridutta in i coacervati cumparatu cù e proteine ​​​​in a fase dispersa per via di l'effetti molecolari pronunciati, ancu se tutti i coacervati conservanu proprietà di liquidu durante a prima meza ora dopu a so furmazione, in cuntrastu à a fase tau.cinetica più veloce in u condensatu pLK.
a–c FRAP analisi di a dinamica αS (2% AF488-labeled αS) in coacervati elettrostatici.L'imaghjini rapprisentanti di l'analisi αS/Tau441 FRAP in triplicate sò mostrati in (a), induve i cerchi rossi indicanu spazii decolorati.A barra di scala hè 5 µm.b Curve FRAP medie e (c) coefficienti di diffusione calcolati (D) per 5-6 (N) gocce diverse da tre esperimenti usando 100 µM αS e concentrazioni equimolari di Tau441 (rosso) o ΔNt-Tau (blu) o pLK (verde) à dece volte a cuncentrazione di LLPS.A deviazione standard di a curva FRAP hè indicata in u culore sfumatu.Per paragone, u coefficiente di diffusione αS in a fase dispersa hè statu determinatu in triplicate utilizendu a spettroscopia di correlazione di fluorescenza (FCS) (vede a Figura Supplementaria 3 è i metudi per più infurmazione).d Spettri EPR continui in banda X di 100 μM TEMPOL-122-αS in tampone LLPS senza alcuna policazione (nera) o in presenza di 100 μM Tau441 (rosso) o ΔNt-Tau (blu) o 1 mM pLK (verde).L'inseritu mostra una vista magnificata di e linee forti di u campu induve si verificanu i cambiamenti più drammatici.e Curve di legame di 50 μM TEMPOL-122-αS con vari policcationi in assenza di LLPS (senza PEG).L'amplitude ridutta di a banda III paragunata à a banda II (IIII/III) di u spettru EPR normalizatu hè indicatu per aumentà i rapporti molari di Tau441 (rossu), ΔNt-Tau (blu) è pLK (verde).E linee culurite mostranu l'adattazione à e dati utilizendu un mudellu di ligame grossu cù n siti di ubligatoriu identici è indipendenti nantu à ogni curva.I dati crudi sò furniti in forma di schedarii di dati crudi.
Cum'è un cumplementu, avemu investigatu a dinamica di αS in diversi coacervati utilizendu l'etichettatura di spin diretta (SDSL) è a risonanza paramagnetica elettronica continua (CW-EPR).Stu metudu hà dimustratu per esse assai utile in rapportu a flessibilità è a dinamica di l'IDP cù una risoluzione residuale realistica36,37,38.A tal fine, abbiamo costruito residui di cisteina in singoli mutanti Cys e abbiamo utilizzato la sonda spin 4-idrossi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-ossil (TEMPOL).I derivati ​​maleimide li etichettanu.Plus précisément, on a inséré des sondes TEMPOL à la position 122 ou 24 αS (TEMPOL-122-αS et TEMPOL-24-αS).In u primu casu, circhemu a regione C-terminale di a proteina, chì hè implicata in l'interazzione cù i policationi.Invece, a pusizione 24 pò dà infurmazione nantu à a dinamica generale di e proteine ​​​​in u condensatu.In i dui casi, i signali EPR ottenuti per e proteine ​​​​di a fase dispersa currispondenu à i radicali di nitroxide in u statu di muvimentu veloce.Dopu a separazione di fasi in presenza di tau o pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 o ΔNt-Tau à un rapportu di 1: 1 o pLK à un rapportu di 1: 10), un aumentu di l'intensità di piccu relativo hè stata osservata in u spettru EPR di αS.A linea di perdita allargata, chì indica a cinetica di riorientazione αS ridutta in gocce paragunate à a proteina in fase diluita (Fig. 3d, Supplementary Fig. 4a).Questi cambiamenti sò più pronunzianu in a pusizione 122. Mentre à a pusizione 24 a prisenza di pLK ùn hà micca affettatu a cinetica di a sonda, in a pusizione 122 a forma di a linea spettrale hà cambiatu significativamente (Figura Supplementaria 4a).Quandu avemu pruvatu à mudificà i spettri in a pusizione 122 di dui sistemi αS / policationi utilizendu u mudellu isotropu (Figura Supplementaria 5a) comunmente utilizatu per descriverà a dinamica di l'IDP38,39 marcatu spin, ùn pudemu micca ricustruisce i spettri sperimentali..Simulazione spettrale di a pusizione di 24 spins cuntrasti (Supplementary Fig. 5a).Questu suggerisce chì ci sò pusizioni preferenziali in u spaziu di cunfigurazioni di spin di a regione C-terminale di αS in presenza di polycations.Quandu si cunsiderà a frazione di αS in a fase condensata in cundizioni EPR sperimentali (84 ± 2%, 79 ± 7%, è 47 ± 4% per αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, è αS/pLK, rispettivamente-vede Supplementary Fig. 2e di l'analisi di dati c), pò esse vistu chì l'allargamentu rilevatu da u metudu EPR riflette principarmenti l'interazzione di a regione C-terminale di αS cù diversi polycations in a fase condensata (u cambiamentu principale quandu si usa TEMPOL-122-). αS), è micca a condensazione di a proteina.Un aumentu di a microviscosità hè osservatu in a sonda.Cum'è s'aspittava, u spettru EPR di a proteina in cundizzioni altru ch'è LLPS hè stata completamente restaurata quandu 1 M NaCl hè stata aghjunta à a mistura (Figura supplementaria 4b).In generale, i nostri dati suggerenu chì i cambiamenti rilevati da CW-EPR riflette principalmente l'interazzione di a regione C-terminale di αS cù diversi policationi in a fase condensata, è questa interazzione pare esse più forte cù pLK chè cù Tau.
Per ottene più infurmazione strutturale nantu à e proteine ​​​​in u coacervate, avemu decisu di studià u sistema LLPS utilizendu NMR in suluzione.Tuttavia, pudemu solu detectà a frazione αS chì resta in a fase dispersa, chì pò esse dovuta à una dinamica di proteina ridotta in u coacervate è una fase densa in u fondu di a suluzione in l'analisi RMN.Quandu avemu analizatu a struttura è a dinamica di a proteina chì resta in a fase dispersa di u campionu LLPS utilizendu NMR (Figura Supplementaria 5c, d), avemu nutatu chì a proteina si cumportava quasi identica in a presenza di pLK è ΔNt-Tau, tramindui chì eranu in struttura secundaria è dinamica di a spina di a proteina, revelata da esperimenti nantu à u cambiamentu chimicu secundariu è a rilassazione R1ρ.I dati di NMR mostranu chì u C-terminale di αS soffre una perdita significativa di flessibilità conformazionale mentre mantene a so natura disordinata, cum'è u restu di a sequenza di a proteina, per via di e so interazzione cù i policationi.
Siccomu l'allargamentu di u signale CW-EPR osservatu in a fase condensata TEMPOL-122-αS riflette l'interazione di a proteina cù i policationi, avemu realizatu una titrazione EPR per valutà l'affinità di legame di αS à vari policationi in assenza di LLPS (nessuna accumulazione di LLPS). Buffer LLPS), suggerenu chì l'interazzione sò listessi in fasi dilute è cuncentrati (chì hè cunfirmatu da i nostri dati, Supplementary Fig. 4a è Supplementary Fig. 6).L'obiettivu era di vede s'ellu tutti i coacervati, malgradu e so proprietà cumune di fluidu, mostranu un cumpurtamentu differenziale sottumessu à u livellu moleculare.Cum'è previstu, u spettru EPR allargatu cù l'aumentu di a concentrazione di polycation, chì riflette una diminuzione di a flessibilità moleculare per l'interazzione moleculare di tutti i partenarii di interazzione quasi à a saturazione (Fig. 3e, Supplementary Fig. 6).pLK hà ottenutu questa saturazione à un rapportu molare più bassu (policazione:αS) cumparatu cù ΔNt-Tau è Tau441.Infatti, a comparazione di e dati cù un mudellu di legame approssimativu assumendu n siti di legame identici è indipendenti hà dimustratu chì a constante di dissociazione apparente di pLK (~ 5 μM) hè un ordine di grandezza più bassu di quella di Tau441 o ΔNt-Tau (~ 50 μM). ).µM).Bien qu'il s'agisse d'une estimation approximative, cela suggère que αS a une affinité plus élevée pour les polycations plus simples avec des régions de charge positive continue.Data questa diffarenza di affinità trà αS è diversi policationi, avemu ipotisatu chì e so proprietà di liquidu pò cambià in modu diversu cù u tempu è cusì soffrenu di diversi prucessi LSPT.
Data l'ambiente assai affollatu in u coacervate di a proteina è a natura amiloide di a proteina, avemu osservatu u cumpurtamentu di u coacervate in u tempu per detectà pussibuli prucessi LSPT.Utilizendu a microscopia BF è CF (Figura 4), avemu osservatu chì αS / Tau441 coacerva in una larga misura in soluzione, formando grosse gocce chì cuntattanu è bagnanu a superficia in u fondu di u pozzu / diapositiva cum'è gocce piene, cum'è previstu (Figu Supplementary). .7d);chjamemu queste strutture formate in fondu "rafts di proteina".Questi strutturi sò stati fluidi cum'è conservanu a capacità di fusione (Figura Supplementaria 7b) è puderia esse vistu per parechje ore dopu chì LLPS hè stata attivata (Fig. 4 è Supplementari Fig. 7c).Avemu osservatu chì u prucessu di bagnamentu hè favuritu nantu à a superficia di materiali idrofili piuttostu cà idrofobi (Figura 7a Supplementaria), cum'è previstu per i coacervati elettrostatici cù carichi sbilanciati è cusì alti potenziali di superfici elettrostatica.In particulare, αS / ΔNt-Tau coalescence è rafting sò stati significativamente ridotti, mentri αS / pLK condensate sò significativamente ridotti (Fig. 4).Durante u brevi tempu di incubazione, e gocce di αS/pLK sò stati capaci di coalesce è bagnà a superficia idrofila, ma stu prucessu si ferma rapidamente è dopu à 5 ore d'incubazione, sò stati osservati solu eventi di coalescenza limitati è senza bagnatura.- transizione gel-drip.
Rappresentanti BF (pannelli in scala di grigi) e CF (pannelli destra, αS marcato AF488 in verde) di campioni di coacervato contenenti 100 µM αS (etichetta fluorescente 1%) in tampone LLPS in presenza di 100 µM Tau441 (in alto) fluorescenza ΔN immagini microscopiche -Tau (centru) o 1 mM pLK (fondu) à i tempi d'incubazione diffirenti è alture focali (z, distanza da u fondu di u pianu bè).L'esperimenti sò stati ripetuti 4-6 volte indipindentamente l'una di l'altru cù i stessi risultati.I coacervati αS/Tau441 sò bagnati dopu à 24 ore, furmendu rafts più grande di l'imaghjini.A barra di scala per tutte l'imaghjini hè 20 µm.
Dopu avemu dumandatu se i grandi pool di proteine ​​​​simili di fluidi formati in αS/Tau441 LLPS portanu à l'aggregazione amiloide di qualsiasi proteina studiata.Avemu seguitu a maturazione di αS / Tau441 droplets in u tempu cù a microscopia WF in i stessi cundizioni cum'è sopra, ma utilizendu 1 μM AF488-labeled αS è Atto647N-labeled Tau441 (Fig. 5a).Cum'è aspittatu, avemu osservatu a localizazione cumpleta di a proteina in tuttu u prucessu di maturazione.Curiosamente, da ca.Dopu à l'ora di 5, strutturi più intensi non-circulare sò stati osservati in i rafts, chì avemu chjamatu "punti", alcuni di quelli chì sò stati colocalizzati cù αS, è alcuni sò stati arricchiti in Tau441 (Fig. 5a, frecce bianche).Questi spots sò sempre stati osservati in raft in una misura più grande per αS/ΔNt-Tau chè per αS/ΔNt-Tau.Ùn ci era micca spots distinti in e gocce di i sistemi pLK è Tau incompetenti per a fusione / umidità.Per pruvà se queste macchie chì cuntenenu αS è Tau441 sò aggregati simili à l'amiloide, avemu realizatu un esperimentu simile utilizendu microscopia CF in quale Tau441 hè stata marcata cù Atto647N è 12,5 μM di thioflavin-T (ThT) specificu di l'amiloide hè stata aghjunta da u principiu.tintura.Ancu s'è ThT-staining di αS / Tau441 droplets o rafts ùn hè statu osservatu ancu dopu à 24 h di incubation (Fig. 5b, top row-remaining droplets over rafts di prutezione), strutture ThT-positivi chì cuntenenu Atto647N-Tau441 in i rafts eranu assai debuli.questu replicate a dimensione, a forma è u locu di i spots descritti prima (Fig. 5b, fila media è di fondu), chì suggerenu chì i spots ponu currisponde à aggregati amiloidi formati in coacervates fluidi anziane.
WF 25 μM αS a vari tempi d'incubazione e altezze focali (z, distanza dal fondo non legato) in presenza di 25 μM Tau441 (1 μM AF488 αS e Atto647N-etichettati Tau441) in un pozzetto di una piastra di microscopio con tampone LLPS) .Sei esperimenti sò stati ripetuti indipindentamente cù risultati simili.b Immagine microscopica CF di 25 μM αS in presenza di 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-labeled Tau441) e 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Gocce di proteine ​​​​pesate è rafts è spots di proteine ​​​​dipositati sò mostrati in e fila superiore è media, rispettivamente.A fila inferiore mostra l'imaghjini di rafts è gocce da 3 replicati indipendenti.E frecce bianche indicanu punti ThT-positivi in ​​i dui pannelli.A barra di scala per tutte l'imaghjini hè 20 µm.
Per esaminà in più dettagliu i cambiamenti in a rete di proteine ​​​​coacervate durante a transizione da u liquidu à u solidu, avemu utilizatu l'imaghjini di fluorescenza di a vita (FLIM) è a microscopia di trasferimentu di energia di resonance Förster (FRET) (Figura 6 è Supplementari Figure 8 è 9).Avemu l'ipotesi chì a maturazione coacervata di a strata in una struttura di proteina aggregata più condensata o ancu solida porta à un cuntattu più strettu trà a proteina è a sonda fluorescente attaccata à ella, pruduciendu potenzialmente un effettu di spegnimentu manifestatu in una durata di vita di sonda ridotta (τ). , cum'è descrittu prima40.,41 ,42.Inoltre, per i campioni doppia etichettati (AF488 è Atto647N cum'è coloranti donatori è accettori FRET, rispettivamente), sta diminuzione di τ pò ancu esse accumpagnata da a condensazione di coacervate è un aumentu di l'efficienza FRET (E) durante LSPT.Abbiamo monitorato la formazione di zattere e spot nel tempo in campioni LLPS αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau (25 µM di ogni proteina nel tampone LLPS contenente 1 µM AF488 marcato αS e/o Atto647N marcato Tau441 o ΔNt-Tau).Avemu osservatu una tendenza generale in chì a vita di fluorescenza di e sonde AF488 (τ488) è Atto647N (τ647N) diminuite ligeramente cum'è i coacervati maturu (Fig. 6 è Supplementary Fig. 8c).Curiosamente, sta mudificazione hè stata rinfurzata significativamente per i punti in rafts (Fig. 6c), chì indicanu chì a più cundensazione di a proteina hè accaduta à i punti.À u sustegnu di questu, ùn hè statu osservatu un cambiamentu significativu in a vita di fluorescenza per i gocce αS / ΔNt-Tau invechjate per 24 h (Figura supplementaria 8d), suggerendu chì a gelazione di gocce hè un prucessu distintu da spotting è chì ùn hè micca accumpagnatu da una riurganizazione moleculare significativa. all'interno di coacervati.Hè devi esse nutatu chì i punti anu diverse dimensioni è cuntenutu variabile in αS, in particulare per u sistema αS / Tau441 (Figura Supplementaria 8e).A diminuzione di a vita di fluorescenza spot hè stata accumpagnata da un aumentu di l'intensità, in particulare per Atto647N marcatu Tau441 (Figura supplementaria 8a), è efficienza FRET più altu per i sistemi αS / Tau441 è αS / ΔNt-Tau, chì indicanu più condensazione in LLPS Cinque ore. dopu l'attivazione, i proteini in l'elettricità statica si sò condensati.Par rapport à αS/ΔNt-Tau, nous avons observé des valeurs de τ647N inférieures et un peu plus élevées de τ488 dans les spots αS/Tau441, accompagnées de valeurs FRET plus basses et plus inhomogènes.Possibile, questu pò esse ligatu à u fattu chì in u sistema αS / Tau441, l'abbundanza di αS osservata è prevista in aggregati hè più eterogenea, spessu substoichiometrica paragunata à Tau, postu chì Tau441 stessu pò ancu esse sottumessi à LLPS è aggregazione (Figura Supplementaria 8e) .Tuttavia, u gradu di coalescenza di gocce, a furmazione di raft, è, più impurtante, l'aggregazione di proteine ​​​​in coacervati liquid-like hè massimu quandu Tau441 è αS sò prisenti.
Una microscopia a fluorescenza a vita (FLIM) immagini di αS/Tau441 e αS/ΔNt-Tau a 25 μM di ciascuna proteina (1 μM αS marcato AF488 e 1 μM Tau441 o tampone ΔNt-Tau marcato Atto647N) in .I culonni mostranu l'imaghjini rapprisentanti di i campioni di LLPS in diversi tempi di maturazione (30 min, 5 h è 24 h).U quadru rossu mostra a regione chì cuntene spots αS/Tau441.I tempi di vita sò indicati cum'è barre di culore.Barra di scala = 20 µm per tutte l'imaghjini.b Image FLIM zoomata di l'area selezziunata, mostrata in a casella rossa in u pannellu a.I intervalli di vita sò indicati cù a listessa scala di culore cum'è in u pannellu a.Barre d'échelle = 5 µm.c Istogrammi che mostrano AF488 (attaccato a αS) o Atto647N (attaccato a Tau) per diverse specie di proteine ​​(goccioline-D-, raft-R- e speckle-P) identificate in immagini FLIM registrate per αS-) distribuzioni temporali di vita di Tau441 e Campioni di coacervate αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI per D, 29-44 ROI per R, e 21-51 ROI per i punti).I valori medii è mediani sò indicati cum'è quadrati gialli è linii neri in scatuli, rispettivamente.I limiti inferiori è superiori di a casella rapprisentanu u primu è u terzu quartile, rispettivamente, è i valori minimi è massimi in u intervallu interquartile di 1,5 volte (IQR) sò indicati cum'è whiskers.Outliers sò mostrati cum'è diamanti neri.A significazione statistica trà coppie di distribuzioni hè stata determinata utilizendu un test t di dui campioni, assumendu varianze ineguali.I valori p di test t à duie code sò indicati cù asterischi per ogni coppia di dati paragunati (* p-value> 0,01, ** p-value> 0,001, *** p-value> 0,0001, **** p-value > 0,00001), ns Indica negligibility (p-value > 0,05).I valori p esatti sò dati in a Tabella Supplementaria 1, è i dati originali sò presentati cum'è file di dati crudi.
Per dimustrà ulteriormente a natura amiloide di speckles / aggregati, avemu trattatu campioni di coacervate senza macchia per 24 ore cù alta concentrazione di (1 M) NaCl, chì hà risultatu in a separazione di aggregati da coacervates di proteina.Quandu l'agregati isolati (vale à dì, una suluzione dispersa di aggregati) sò stati osservati cù a microscopia di forza atomica (AFM), avemu osservatu una morfologia principarmenti sferica cù una altezza regulare di circa 15 nm, chì tende à associà in cundizioni di alta concentrazione di sali, simile à u cumpurtamentu di i fibri amiloidi tipici per u forte effettu idrofobicu nantu à a superficia (nota chì e fibrille tipicamente anu una altezza di ~ 10 nm) (Figura supplementaria 10a).Curiosamente, quandu l'aggregati isolati sò stati incubati cù ThT in un test di fluorescenza ThT standard, avemu osservatu un aumentu drammaticu di u rendiment quantum di fluorescenza ThT, paragunabile à quellu osservatu quandu u tintu hè incubatu cù fibrille amiloidi αS tipiche (Figura supplementaria 10b), suggerendu chì l'aggregati coacervati cuntenenu strutture amiloide..In fattu, l'agregati eranu tolleranti à alta concentrazione di sali, ma sensittivi à 4 M guanidine chloride (GdnHCl), cum'è fibrilli amiloidi tipici (Figura supplementaria 10c).
In seguitu, avemu analizatu a cumpusizioni di l'aggregati utilizendu a fluorescenza di una sola molecula, a spettroscopia di correlazione / correlazione incrociata di fluorescenza specifica (FCS / FCCS), è l'analisi di burst di rilevazione di coincidenza di dui culori (TCCD).A tal fine, abbiamo isolato aggregati formati dopo 24 ore di incubazione in campioni LLPS da 100 μl contenenti αS e Tau441 (entrambi 25 μM) insieme a 1 μM di αS marcato AF488 e 1 μM di Tau441 marcato Atto647N.Dilute a suluzione aggregata dispersa risultante à un statu monomolecular utilizendu u stessu buffer senza PEG è 1 M NaCl (u stessu buffer utilizatu per separà l'aggregati da u coacervate) per prevene qualsiasi interazzione elettrostatica pussibuli trà LLPS è proteina.Un esempiu di a trajectoria di u tempu di una sola molécula pò esse vistu in Fig.L'analisi FCCS / FCS (correlazione incruciata, CC è autocorrelazione, AC) hà dimustratu chì l'aggregati chì cuntenenu αS è tau eranu abbundanti in i campioni (vede a curva CC in Fig. 7b, pannellu di manca), è un eccessu di proteina monomerica residuale hè nata cum'è un risultatu di u prucessu di diluzione (vede curve AC in Figura 7b, panel left).L'esperimenti di cuntrollu realizati in i stessi cundizioni di suluzione cù mostre chì cuntenenu solu proteini monomerichi ùn anu micca mostratu curve CC, è e curve AC si adattanu bè cù u mudellu di diffusione d'una cumpunente (Eq. 4), induve i proteini monomerici anu u coefficient di diffusione previstu (Fig. 7b). ), pannellu drittu).U coefficient di diffusione di particelle aggregate hè menu di 1 µm2/s, è quellu di e proteine ​​monomeriche hè di circa 1 µm2/s.50-100 µm/s;i valori sò simili à i valori publicati in precedenza per fibrille amiloidi αS sonicate è αS monomeriche separatamente in cundizioni di soluzione simili44.Quandu avemu analizatu l'aggregati cù l'analisi di l'esplosione TCCD (Fig. 7c, pannellu superiore), truvamu chì in ogni aggregate isolatu (αS / Tau heteroaggregate), circa 60% di l'aggregati rilevati cuntenenu sia αS è tau, circa 30% cuntene solu. tau, circa 10% αS solu.L'analisi stechiometrica di l'eteroaggregati αS/Tau hà dimustratu chì a maiò parte di l'eteroaggregati sò stati arricchiti in tau (stechiometria sottu 0,5, u numeru mediu di molecule tau per aggregatu hè 4 volte più di molecule αS), chì hè coherente cù u nostru travagliu osservatu in FLIM in situ. esperimenti..L'analisi FRET hà dimustratu chì questi aggregati cuntenenu e duie proteine, ancu s'è i valori FRET attuali in questu casu ùn sò micca di grande impurtanza, postu chì a distribuzione di fluorofori in ogni aggregatu era casuale per via di un eccessu di proteina senza etichetta utilizata in l'esperimentu.Curiosamente, quandu avemu fattu a listessa analisi utilizendu a variante Tau di aggregazione amiloide matura 45,46 (vede Supplementary Fig. 11a, b), avemu nutatu chì ancu se l'agregazione elettrostatica αS era a stessa (Supplementary Fig. 11c, d). a capacità di furmà aggregati in u coacervate hè stata drasticamente ridutta è FLIM hà rilevatu parechji spots in esperimenti in situ, è debuli curre di correlazione croce sò stati osservati per campioni aggregati isolati.Tuttavia, per un picculu numeru di aggregati rilevati (solu un decimu di Tau441), avemu osservatu chì ogni aggregatu era arricchitu in αS cà sta variante Tau, cù circa 50% di l'aggregati rilevati chì cuntenenu solu molecule αS, è αS era eterogeneu in eccesso. .aggregates (vede Supplementary Fig. 11e), in cuntrastu à l'agregati heterogeneous generati da Tau441 (Fig. 6f).I risultati di sti esperimenti anu dimustratu chì ancu αS stessu hè capace di accumulà cù tau in u coacervate, a nucleazione di tau hè più favurevule in queste cundizioni, è l'aggregati amiloidi risultanti sò capaci di agisce cum'è una forma di αS è tau.In ogni casu, una volta chì un core riccu di tau hè furmatu, l'interazzioni eterotipichi trà αS è tau sò favuriti in aggregati annantu à l'interazzione omotipica trà e molécule tau;On observe également des réseaux de protéines dans les coacervats αS/tau liquides.
a Tracce temporali di fluorescenza rappresentativa di singole molécules di aggregati isolati formate in coacervati elettrostatici αS/Tau441.Bursts currispondenti à i coaggregati αS/Tau441 (bursts sopra a soglia indicata) sò stati osservati in trè canali di rilevazione (emissione AF488 è Atto647N dopu eccitazione diretta, linee blu è rosse, emissione Atto647N dopu eccitazione indiretta), FRET, linea viola).b Analisi FCS/FCCS di un campione di aggregati isolati αS/Tau441 ottenuti da LLPS (pannellu di sinistra).E curve di autocorrelazione (AC) per AF488 è Atto647N sò mostrate in blu è rossu, rispettivamente, è e curve di correlazione incruciata (CC) assuciate cù aggregati chì cuntenenu i dui tinti sò mostrati in viola.E curve AC riflettenu a prisenza di spezie monomeriche è aggregate di prutezione, mentre chì e curve CC mostranu solu a diffusione di aggregati doppia etichettati.A stessa analisi, ma in e stesse cundizioni di suluzione cum'è in spots isolati, i campioni chì cuntenenu solu αS monomericu è Tau441 sò mostrati cum'è cuntrolli in u pannellu ghjustu.c Analisi flash di fluorescenza di singole molecule di aggregati isolati formati in coacervati elettrostatici αS/Tau441.L'infurmazione per ogni aggregatu truvata in quattru ripetizioni differenti (N = 152) hè tracciata contru à a so stechiometria, i valori S è l'efficienza FRET (pannellu superiore, barra di culore riflette l'occurrence).Trè tipi di aggregati ponu esse distinti: -aS-solu aggregati cù S~1 è FRET~0, Tau-only aggregati cù S~0 è FRET~1, è eterogenei Tau/αS aggregati cù intermedi S è FRET Stime di a quantità di i dui prutini di marcatura rilevati in ogni aggregatu eterogeneu (N = 100) sò mostrati in u pannellu inferiore (a scala di culore riflette l'occurrence).I dati crudi sò furniti in forma di schedarii di dati crudi.
A maturazione o l'anziane di i condensati di prutezione liquida in strutture simili à gel o solidi cù u tempu hè statu infurmatu chì hè implicatu in parechje funzioni fisiulogichi di u condensatu47 è ancu in a malatia, cum'è un prucessu anormale chì precede l'agregazione amiloide 7, 48, 49. studiemu a separazione di fasi è u cumpurtamentu in dettaglio.LSPT αS in presenza di polycations casuali in un ambiente cuntrullatu à bassu cuncentrazione micromolar è cundizioni fisiologicamente rilevanti (nota chì a cuncentrazione fisiologica calculata di αS hè> 1 µM50), dopu un tipicu cumpurtamentu termodinamicu di LPS.Avemu trovu chì αS, chì cuntene una regione C-terminale altamente carica negativamente à pH fisiologicu, hè capaci di furmà gocce ricche di proteine ​​​​in soluzione acquosa via LLPS in presenza di peptidi disordinati altamente cationici, cum'è pLK o Tau, attraversu u prucessu di elettrostatica. cundensazione cumplessa in a prisenza di macromolecules aggregation.Stu prucessu pò avè effetti pertinenti in l'ambiente cellulare induve αS scontra diverse molécule policationiche assuciate cù a so aggregazione associata à a malatia in vitro è in vivo51,52,53,54.
In parechji studii, a dinamica di a proteina in gocce hè stata cunsiderata cum'è unu di i fatturi chjave chì determinanu u prucessu di maturazione55,56.In αS elettrostatica coacervate cù polycations, u prucessu di maturazione apparentemente dipende da a forza di l'interazzione cù i polycations, a valenza è a multiplicità di sti interazzione.A teoria di l'equilibriu suggerisce chì un paisaghju d'equilibriu di dui stati liquidi seria a presenza di una grande goccia ricca in biopolimeri chì guidanu LLPS57,58.A crescita di goccia pò esse ottenuta da a maturazione Ostwald59, a coalescenza60 o u cunsumu di monomeru liberu in a fase dispersa61.Per αS è Tau441, ΔNt-Tau o pLK, a maiò parte di a proteina hè stata cuncentrata in u condensatu in e cundizioni utilizati in stu studiu.Tuttavia, mentre chì e gocce di tau full-size s'uniscenu rapidamente nantu à a bagnatura di a superficia, a coalescenza di a goccia è a bagnatura eranu difficili per ΔNt-Tau è pLK, suggerendu una rapida perdita di proprietà di liquidu in questi dui sistemi.Sicondu a nostra analisi FLIM-FRET, e gocce invecchiate pLK è ΔNt-Tau dimustravanu un gradu simile di aggregazione di proteine ​​​​(vita di fluorescenza simile) cum'è e gocce originali, suggerendu chì a rete di proteina originale hè stata mantenuta, anche se più rigida.
Razionalizzamu i nostri risultati spirimintali in u mudellu seguente (Figura 8).I gocce inizialmente furmati temporaneamente sò spessu rete di prutezione senza compensazione elettrostatica, è cusì ci sò spazii di sbilanciamentu di carica, in particulare à l'interfaccia di gocce, risultatu in gocce cù un altu putenziale di superficia elettrostatica.Per cumpensà a carica (un fenomenu cumunimenti chjamatu depletion di valenza) è minimizzà u potenziale di a superficia di e gocce, e gocce ponu include novi polipeptidi da a fase diluita, riorganizà e rete di proteine ​​​​per ottimisà l'interazzione di carica-carica, è interagisce cù altre gocce.cù superfici (wetting).E gocce αS/pLK, per via di a so rete di proteina più simplice (solu interazzioni heterotypic trà αS è pLK) è più grande affinità per l'interazzione proteina-proteina, parenu esse capaci di equilibrà a carica di u condensatu più rapidamente;infatti, avemu osservatu una cinetica di proteina più veloce in coacervati αS/pLK inizialmente formati cà in αS/Tau.Dopu à a depletion di valenza, l'interazzione diventanu menu effimera è e gocce perdenu e so proprietà di liquidu è si trasformanu in gocce gel-like, non-infiammabili cù un potenziale di superficia elettrostatica bassu (è dunque incapaci di bagnà a superficia).In cuntrastu, e gocce αS / Tau sò menu efficaci per ottimisà l'equilibriu di carica di goccia per via di e rete di proteine ​​​​più cumplesse (cù interazzioni omotipiche è heterotipiche) è a natura più debule di l'interazzione di proteine.Questu risultatu in gocce chì conservanu u cumpurtamentu di u liquidu per periodi estesi di tempu è mostranu un altu potenziale elettrostaticu di a superficia chì tende à esse minimizatu da a coalescenza è a crescita (cusì minimizendu u rapportu superficie / volume di e gocce) è bagnendu a chimica di a superficia idrofila.Questu crea grande librerie di proteine ​​​​cuncentrate chì conservanu e proprietà di fluidu cum'è l'interazzione restanu assai transitori per via di a ricerca constante di l'ottimisazione di carica in a rete di prutezione.Curiosamente, e forme troncate N-terminali di Tau, cumprese alcune isoforme naturali62, mostranu un cumpurtamentu intermediu, cù alcuni coacervati chì invechjanu cù αS in gocce di gel-like long-life, mentre chì altri si trasformanu in grandi condensati liquidi.Questa dualità in a maturazione di i coacervati elettrostatici αS hè coherente cù i recenti studii teorichi è sperimentali di LLPS chì anu identificatu una correlazione trà a depletion di valenza è u sieving elettrostaticu in condensati cum'è una chjave per cuntrullà a dimensione di condensate è e proprietà di fluidu.Meccanismu 58.61.
Stu schema mostra a via di aggregazione di l'amiloide putativa per αS è Tau441 via LLPS è LSPT.Cù regioni ricche di anioni (rossu) è ricche di cationi (blu), i coacervati elettrostatici αS è tau cun valenza soddisfacente anu una energia di superficia più bassa è dunque menu coalescenza, risultatu in un rapidu invecchiamentu di gocce.Un statu di gel stabile non agglomeratu hè ottenutu..Questa situazione hè assai favurevule in u casu di u sistema αS/pLK per via di a so affinità più alta è di a reta di interazione di proteina-coppia più simplice, chì permette una transizione rapida cum'è gel.À u cuntrariu, gocce cù valenza insatisfactoria è, dunque, regioni cariche di proteine ​​​​disponibili per l'interazzione, facenu più faciule per u coacervatu per fusione è bagnà a superficia idrofila per riduce a so energia di superficia alta.Questa situazione è preferibile per i coacervati αS/Tau441, che hanno una rete complessa multivalente costituita da interazioni deboli Tau-Tau e αS-Tau.À u turnu, i coacervati più grossi conservanu più facilmente e so proprietà di fluidu, chì permettenu altre interazzione proteina-à-proteina.Eventualmente, aggregati eterogenei amiloidi chì cuntenenu αS è tau si formanu in u fluidu coacervate, chì ponu esse ligati à quelli chì si trovanu in i corpi d'inclusione, chì sò segni distintivi di e malatie neurodegenerative.
I grandi strutture fluidi-like formate durante a maturazione di αS/Tau441 cun un ambiente di proteina altamente congestionatu ma dinamicu è, in una misura più minima, i coacervati αS/ΔNt-Tau sò serbatoi ideali per a nucleazione di l'aggregazione di proteine.Avemu daveru osservatu a furmazione di aggregati di proteini solidi in stu tipu di coacervati di prutezione, spessu cuntenenu sia αS sia tau.Avemu dimustratu chì questi eteroaggregati sò stabilizati da interazzioni non-elettrostatiche, sò capaci di unisce i tinti ThT specifichi di l'amiloide in u listessu modu cum'è fibrilli amiloidi tipici, è daveru anu una resistenza simile à diverse influenze.L'aggregati αS/tau formati da LLPS sò stati dimustrati per avè proprietà amiloide.Infatti, a variante matura di Tau carente in aggregazione amiloide hè significativamente alterata in a furmazione di questi aggregati αS eterogenei in u coacervatu elettrostaticu liquidu.A furmazione di aggregati αS/Tau441 hè stata osservata solu à l'internu di i coacervati, chì conservavanu proprietà liquid-like, è mai, se i coacervati/gocciolini ùn anu micca righjuntu u statu di gel.In l'ultimu casu, a forza aumentata di l'interazzione elettrostatica è, in u risultatu, a rigidità di a reta di a proteina impediscenu i rearrangiamenti conformational necessarii di e proteine ​​​​per stabilisce novi interazzioni di proteini necessarii per a nucleazione amiloide.In ogni casu, questu pò esse realizatu in coacervati più flexibuli, cum'è liquidu, chì à u turnu sò più prubabile di stà liquidu cum'è crescenu in grandezza.
U fattu chì a furmazione di aggregati in a fase condensata hè preferibile in grandi condensati αS/Tau cà in picculi gocce chì si gelificanu rapidamente, mette in risaltu a rilevanza di identificà i fatturi chì cuntrolanu a coalescenza di gocce.Cusì, ùn hè micca solu una tendenza per a separazione di fasi, ma a dimensione di u condensatu deve esse cuntrullata per u funziunamentu propiu è a prevenzione di e malatie58,61.I nostri risultati evidenzianu ancu l'impurtanza di l'equilibriu trà LLPS è LSPT per u sistema αS/Tau.Mentre a furmazione di gocce pò prutege contr'à l'agregazione amiloide riducendu a quantità di monomeri di proteina dispunibili in cundizioni di saturazione, cum'è hè statu prupostu in altri sistemi63,64, a fusione di gocce à livelli elevati di gocce pò purtà à l'aggregazione interna di proteine ​​​​per via di riarrangiamenti conformazionali lenti.rete di proteini..
In generale, i nostri dati enfatizzanu fermamente a rilevanza di a valenza coesiva è l'interazzioni soddisfatti / insoddisfatti in e rete di goccia in u cuntestu di LSPT.In particulare, mostramu chì i condensati αS/Tau441 di lunghezza completa sò capaci di fusione è nucleate in modu efficiente per furmà eteroaggregati amiloidi chì includenu e duie proteine ​​​​è prupone un mecanismu moleculare basatu nantu à i nostri risultati sperimentali.A co-agregazione di duie proteine ​​​​in u coacervatu fluidu αS / Tau chì avemu rapportatu quì pò esse veramente ligata à a co-localizazione di duie proteine ​​​​in inclusioni, chì sò segni distintivi di a malatia, è pò cuntribuisce à capisce a relazione trà LLPS è aggregazione amiloide, aprendu a strada per IDP altamente carica in neurodegenerazione.
Monomeri WT-αS, mutanti di cisteina (Q24C-αS, N122C-αS) è varianti ΔCt-αS (Δ101-140) sò stati spressi in E. coli è purificati cum'è descrittu prima.5 mM DTT hè stata inclusa in tutti i passi di a purificazione di mutanti di cisteina αS per impedisce a furmazione di legami disulfuru.L'isoforma Tau441 (plasmide ottenuta da Addgene #16316), la variante ΔNt-Tau (Δ1–150, ottenuta clonando IVA con primer CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) e la variante AggDef-Tau-AggDef-Tau purificata con cultura G31TC, ΔGC coli (ΔGC, ΔGC 75). cultivatu à OD600 = 0,6-0,7 à 37 ° C è 180 rpm, è l'espressione hè stata indutta cù IPTG per 3 ore à 37 ° C.Raccogliere e cellule a 11.500 xg per 15 minuti a 4 °C e lavare con tampone salino contenente 150 mM NaCl.Risospendere il pellet in tampone di lisi (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidina 50 μM, copeptina μM100).U passu di sonicazione hè stata realizata nantu à u ghjacciu cù una amplitude di 80% per 10 impulsi (1 min on, 1 min off).Ùn trapassa 60 ml in un ultrasound.I lisati di E. coli sò stati riscaldati à 95 ° C per 20 minuti, dopu rinfriscati nantu à u ghjacciu è centrifugati à 127 000 × g per 40 minuti.U surnatante clarificatu hè statu applicatu à una membrana da 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) è dializatu contr'à 4 L di tampone di dialisi (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM). , PMSF 0,1 mM) per 10 ore.Una colonna di scambio cationico da 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) è stata equilibrata con tampone di equilibrazione (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).U tau lysate hè stata filtrata attraversu un filtru PVDF di 0,22 μm è injected in a colonna à un flussu di 1 ml / min.L'eluzione hè stata fatta gradualmente, tau hè stata eluita cù 15-30% buffer di eluzione (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).E frazioni sò state analizate da SDS-PAGE, è qualsiasi frazioni chì cuntenenu una banda cù u pesu moleculare previstu di tau sò stati cuncentrati cù un filtru di centrifuga 10 kDa è rimpiazzati cù un buffer chì cuntene 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM è DTT 2 mM per a concentrazione di proteina finale era 100 μM.A suluzione di prutezione hè stata passata à traversu un filtru PVDF 0,22 μm, rapidamente congelata è almacenata à -80 ° C.A proteina K18 hè stata gentilmente furnita da u prufessore Alberto Boffi.A purezza di a preparazione era> 95% cum'è cunfirmatu da SDS-PAGE è MALDI-TOF/TOF.Diverse cisteine ​​sono state marcate chimicamente con AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) o TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).sò stati cunfirmati da assorbanza è MALDI-TOF / TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau è K18 sò stati etichettati cù residui di cisteina nativa in e pusizioni 191 è 322 cù Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germania) seguendu a stessa prucedura.A carica netta per carte di residuu per αS è Tau441 sò stati generati cù CIDER66.
A poli-L-lisina solida (pLK DP 90-110 secondu a NMR da u fornitore, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) hè stata dissolta in 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 à 10 mM concentrazione, prucessu sonicatu per 5 minuti in un bagnu d'acqua ultrasonica è guardate à -20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) è FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) sò solubili in acqua è largamente distribuiti in buffer LLPS.La dialisi elimina i sali contaminanti.Dopu sò stati filtrati à traversu un filtru di siringa cù una dimensione di poru di 0,22 μm, è e so concentrazioni sò stati calculati cù un refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).I campioni di LLPS sò stati preparati à a temperatura di l'ambienti in l'ordine seguente: tampone è estrusione sò stati mischiati è 1 mM tris(2-carboxyethyl)fosfina (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane-). 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) è una mistura di 1% inibitore di proteasi (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Poi si aggiungono αS e policcationi fusi (opzioni pLK o Tau).Per l'esperimenti di serie temporale di tioflavina-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), utilizate a cuncentrazione totale di ThT per esse a mità di a cuncentrazione αS.Imbulighjate delicatamente ma accuratamente i campioni per assicurà chì sò omogenei.A cuncentrazione di ogni cumpunente variava da esperimentu à esperimentu, cum'è descrittu in a sezione Risultati.Azide hè stata utilizata à una cuncentrazione di 0,02% (w / v) quandu a durata di l'esperimentu superava 4 ore.Per tutte l'analisi chì utilizanu campioni LLPS, permettenu chì a mistura si equilibra per 5 minuti prima di l'analisi.Per l'analisi di scattering di luce, 150 µl di campioni sò stati caricati nantu à microplate di 96 pozzetti non vincolanti (µClear®, nero, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) è coperto cù film adesivo.I LLP sò stati monitorati misurando l'assorbanza à 350 nm à u centru di a suluzione in un lettore di piastra CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Germania).L'esperimenti sò stati realizati in triplicate à 25 ° C, è l'errore sò stati calculati cum'è a deviazione standard da a media.A fase diluita hè stata quantificata per centrifugazione di campioni è analisi di gel SDS-PAGE, è a frazione αS in e fasi diluite è cuncentrate hè stata quantificata in diverse soluzioni LLPS.Un campione LLPS da 100 μl contenente αS etichettato con AF488 1 μM è stato preparato da un miscuglio accurato seguito da una centrifugazione a 9600 × g per 30 minuti, dopodiché il precipitato era generalmente visibile.U top 50 μl di u supernatant hè stata utilizata per a quantificazione di a proteina cù u gel SDS-PAGE.I gels sò stati scannati cù filtri AF488 cù un sistema di imaging di gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) o macchiati cù macchia Coomassie è visualizati cù filtri adatti.I bandi resultanti sò stati analizati utilizendu ImageJ versione 1.53i (Istituti Naziunali di Salute, USA).L'esperimenti sò stati realizati in duplicate in dui esperimenti diffirenti cù risultati simili.
Di genere, 150 μl di campioni sò stati applicati à microplate di 96 pozzetti senza vincolanti è visualizati à a temperatura di l'ambienti nantu à un microscopiu invertitu Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania).Per l'esperimenti spot, sò stati usati ancu piastre d'angiogenesi µ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germania) o micropiatti in polistirene a 96 pozzetti (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).E lampade alogene EL6000 o alogenuri metallici di mercurio sò state aduprate cum'è fonti di illuminazione (per l'imaghjini BF / DIC è WF, rispettivamente).Per a microscopia WF, un obiettivu di l'aria di ingrandimentu 40x (Leica Microsystems, Germania) hè stata utilizata per fucalizza a luce nantu à a mostra è cullà.Per i campioni etichettati AF488 è ThT, filtri di eccitazione è emissione cù filtri standard GFP, filtri passa-banda di eccitazione è emissione, rispettivamente, filtri passa-banda 460-500 nm è 512-542 nm, è un specchiu dicroico 495 nm.Per i campioni marcati cù Atto647N, un set standard di filtri Cy5 cù filtri passa-banda di eccitazione è emissione 628-40 nm è 692-40 nm, rispettivamente, è un specchiu dicroicu 660 nm sò stati utilizati.Per a microscopia BF è DIC, aduprate u listessu scopu di cullizzioni di luce riflessa.A luce raccolta hè stata registrata nantu à una camera CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Germania).U tempu d'esposizione era di 50 ms per l'imaghjini di microscopia BF è DIC è 20-100 ms per l'imaghjini di microscopia WF.Per paragunà, u tempu di esposizione per tutti l'esperimenti cù ThT era 100 ms.Esperimenti di time-lapse sò stati realizati per visualizà a coalescenza di gocce, cù l'imaghjini chì sò cullate ogni 100 ms per parechji minuti.ImageJ (NIH, USA) hè stata utilizata per l'analisi di l'imaghjini.L'esperimenti sò stati realizati in triplicate cù risultati simili.
Per esperimenti di colocalizazione, FRAP è ricostruzione 3D, l'imaghjini sò stati acquistati nantu à un microscopiu cunfocale invertitu Zeiss LSM 880 utilizendu una edizione blu ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germania).Campioni di 50 µl sono stati applicati a piastre Petri µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germania), trattati con un polimero idrofilo (ibiTreat) e montati in un obiettivo a immersione in olio 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) nantu à DIC).L'imaghjini sò stati acquistati utilizendu linee laser argon di 458 nm, 488 nm è 633 nm cù una risoluzione di 0,26 µm/pixel è un tempu di esposizione di 8 µs/pixel per finestre di rilevazione di eccitazione è emissione di 470-600 nm, 493-628 nm, è 638-755 nm sò stati utilizati per visualizà ThT, AF488 è Atto647N, rispettivamente.Per l'esperimenti FRAP, a fotografia time-lapse di ogni mostra hè stata registrata à 1 frame per seconda.L'esperimenti sò stati realizati in triplicate à a temperatura di l'ambienti cù risultati simili.Tutte l'imaghjini sò stati analizati cù u software Zen 2 Blue Edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germania).E curve FRAP sò state normalizzate, tracciate è adattate à e dati di intensità / tempu estratti da l'imaghjini cù Zen 2 cù OriginPro 9.1.E curve di ricuperazione sò state adattate à un mudellu mono-esponenziale per cuntà a diffusione moleculare cù un termu esponenziale supplementu per cuntà l'effettu bleaching d'acquisizione.Dopu avemu calculatu D utilizendu u raghju di sbiancante nominali è a semivita di ricuperazione determinata prima cum'è in l'equazioni di Kang et al.5 35 mostratu.
Varianti singole di cisteina di αS sò state sintetizzate cù 4-idrossi-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) in posizioni 24 (TEMPOL-24-αS) è 122 (TEMPOL-122-αS), rispettivamente.Spin Labelling Per esperimenti EPR, a concentrazione di αS hè stata stabilita à 100 μM è a cuncentrazione di PEG era 15% (w / v).Per diverse condizioni di aggregazione, il rapporto αS:pLK era 1:10, mentre i rapporti αS:ΔNt-Tau e αS:Tau441 erano mantenuti a 1:1.Per l'esperimenti di titrazione di ubligatoriu in l'assenza di affollamentu, TEMPOL-122-αS hè stata mantinuta à 50 μM è i policazioni sò stati titrati à cuncentrazione crescente, preparendu ogni cundizione separatamente.E misurazioni CW-EPR sò state realizate utilizendu un spettrometru di banda X Bruker ELEXSYS E580 equipatu di un risonatore Bruker ER4118 SPT-N1 chì opera à una frequenza di microonde (SHF) di ~ 9.7 GHz.A temperatura hè stata stabilita à 25 ° C è cuntrullata da un criostatu di nitrogenu liquidu.I spettri sò stati ottenuti in cundizioni insaturate à una putenza MW di 4 mW, una amplitude di modulazione di 0,1 mT è una frequenza di modulazione di 100 kHz.L'intensità spettrali sò stati nurmalizzati per evità differenze in a cuncentrazione di spin trà i campioni è a pussibuli riduzzione di spin per via di cuncentrazioni residuali di agenti riducenti in campioni chì cuntenenu Tau441 o ΔNt-Tau (presente in e soluzioni originali di a proteina).I valori dati di g sò stati ottenuti com'è u risultatu di a modellazione spettrale EPR realizata cù u software Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implementatu in Matlab®67.I mudelli isotropichi di unu o dui cumpunenti sò stati utilizati per mudificà e dati.Dopu a normalizazione di tutti i signali, i residuali sò stati calculati sottrattendu ogni simulazione da u spettru sperimentale currispundente.Per l'analisi di titrazioni di ubligatoriu, l'intensità relative di a terza banda à a seconda banda di u spettru EPR normalizatu (IIII / III) hè stata aduprata per monitorizà u ligame di polycations à αS.Per stimà a constante di dissociazione (Kd), a curva risultante hè stata adattata à un mudellu apprussimativu assumendu n siti di legame identici è indipendenti.
L'esperimenti di spettroscopia NMR sò stati realizati cù un spettrometru NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) equipatu di una crioprobe è Z-gradient.Tutti l'esperimenti sò stati realizati utilizendu 130-207 µM αS è corrispondenti αS/ΔNt-Tau è pLK equivalenti in 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 è sò stati eseguiti à 15 ° C.Per monitorà LPS da RMN, 10% PEG hè statu aghjuntu à i campioni pre-mixed.A trama di perturbazione chimica (Fig. 1b) mostra i cambiamenti chimichi mediu 1H è 15N.I spettri αS 2D1H-15N HSQC sò stati attribuiti in basa di una assignazione precedente (entrata BMRB #25227) è cunfirmati da a registrazione è l'analisi di i spettri 3D di HNCA, HNCO è CBCAcoNH.I cambiamenti chimichi 13Cα è 13Cβ sò stati calculati in presenza di ΔNt-Tau o pLK per misurà i pussibuli cambiamenti in e tendenze di a struttura secundaria in paragunà à i cambiamenti chimichi αS in a conformazione di bobina aleatoria pura 68 (Figura supplementaria 5c).I ritmi R1ρ sò stati misurati registrandu esperimenti hsqctretf3gpsi (ottenuti da a libreria Bruker) cù ritardi di 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, è 800 ms, è e funzioni esponenziali sò state adattate à i ritardi di intensità di piccu differente. volte per determinà u R1ρ è a so incertezza sperimentale.
Esperimenti di microscopia di fluorescenza risolta in u tempu di dui culori sò stati realizati nantu à un microscopiu cunfocale di fluorescenza MT200 (PicoQuant, Berlin, Germania) cù un dispositivu di cunti di fotoni unicu (TCSPC) correlati in u tempu.A testa di diodu laser hè aduprata per l'excitazione interleaved pulsata (PIE), u fasciu passa per una guida d'onda di modu unicu è hè sintonizatu à una putenza laser di 10 à 100 nW per linee laser 481 nm è 637 nm misurate dopu un specchiu dicroicu.Questu assicura un ritmu ottimale di conte di fotoni, evitendu l'effetti di l'aliasing di fotoni, photobleaching è saturazione.μ-Slide angiogenesis coverslips o plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germania) sò stati posti direttamente in acqua di immersione nantu à una lente Super Apochromat 60x NA 1.2 cù un collar correttore (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Un specchiu dicroicu 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) hè statu utilizatu cum'è splitter di fasciu principale.A radiazione unfocused hè bluccata da un pirtusu cù un diametru di 50 microns, dopu a radiazione focalizzata hè divisa in 2 percorsi di rilevazione da un splitter di fasciu 50/50.I filtri di emissioni di banda (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 per u tintu verde (AF488) è 690/70 per u tintu rossu (Atto647N) sò stati usati davanti à u detector.I diodi di avalanche à fotonu unicu (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia) sò stati utilizati cum'è detectors.Sia a raccolta di dati sia l'analisi sò stati realizati utilizendu u software SymphoTime64 dispunibule cummerciale (PicoQuant GmbH, Berlin, Germania).
Cinquanta microlitri di campioni di LLPS sò stati applicati à i pozzi d'angiogenesi μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germania).L'imaghjini risultanti sò focalizati à 20 µm sopra u fondu di u pozzu per una distanza di travagliu ottimale per l'obiettivu di gocce sospese è à ~ 1 µm per i rafts è i punti cù una risoluzione assiale di almenu 0,25 µm/pixel è un tempu di ritardu di 400 µs/pixel.Selezziunate i dati appliendu un sogliu di intensità basatu annantu à l'intensità media di u signale di fondo (PBG, media + 2σ) per ogni canale per chì solu gocce di proteina liquida, rafts, o spots sò selezziunati, filtrà ogni urigine pussibule da a fase dispersa.Per analizà a vita di ogni spezia (τ) di ogni canali (verde, "g" per AF488 è rossu, "r" per Atto647N), avemu sceltu regioni d'interessu (ROI) chì cuntenenu gocce, rafts, o spots (Figura supplementaria 1). ).8b) è li derivava da l'adattazione di a so decadenza di a vita (τD, τR è τP per droplets, rafts o spots, rispettivamente, vede Supplementary Fig. 8c) in ogni canali utilizendu una analisi di tail-fit è un mudellu di decadimentu di dui cumpunenti.τ moyenne à partir de τ .ROI chì pruducianu troppu pochi fotoni per un adattamentu multi-esponenziale sò stati esclusi da l'analisi.U cutoff utilizatu era <104 fotoni per rafts è punti è 103 per gocce.E gocce anu un sogliu più bassu perchè hè difficiule d'ottene curve di decadenza cù valori d'intensità più altu, postu chì e gocce in u campu di l'imaghjini sò generalmente più chjuche è menu numerose.ROI cù cunti di fotoni sopra à u limitu di accumulazione di fotoni (impostatu à> 500 conti / pixel) sò stati ancu scartati per l'analisi.Abbinate a curva di decadenza di intensità ottenuta da a regione d'interessu cù una intensità à u 90% di u massimu (pocu dopu à l'intensità massima di a decadenza) da u principiu di a vita di serviziu per assicurà l'interferenza IRF minima mentre mantene a stessa per tutte l'intensità di decadenza. paràmetri Finestra di u tempu Relativu Sò stati analizati 25 à 50 ROI per rafts è spots è 15-25 ROI per gocce, l'imaghjini scelti da più di 4 replicati registrati da almenu 3 esperimenti indipendenti.T-test di dui coda sò stati usati per evaluà e differenze statistiche trà e spezie o trà i sistemi di coacervate.Per una analisi pixel per pixel di a vita (τ), l'attenuazione tutale di a vita nantu à u campu per ogni canale hè stata calculata è hè stata realizata una approssimazione di un mudellu d'attenuazione esponenziale di 2/3 cumpunenti.L'attenuazione di a vita per ogni pixel hè stata allora adattata utilizendu i valori τ previamente calculati, risultatu in una imagine FLIM fit pseudocolor.U intervallu di a vita di a cuda era u stessu in tutte l'imaghjini di u listessu canale, è ogni decadenza hà pruduttu abbastanza fotoni per furnisce un adattamentu affidabile.Per l'analisi FRET, i pixelli sò stati scelti appliendu un sogliu di intensità più bassu di 100 photons, chì mediava un signalu di fondo (FBG) di 11 photons.L'intensità di fluorescenza di ogni canale hè stata corretta da fattori di correzione determinati sperimentalmente: 69 diafonia spettrale α era 0.004, eccitazione diretta β era 0.0305, efficienza di rilevazione γ era 0.517.L'efficienza FRET à u nivellu di pixel hè allora calculata cù l'equazione seguente:
induve FDD hè l'intensità di fluorescenza osservata in u canali di donatore (verde), FDA hè l'intensità di fluorescenza osservata in u canali accettore (rossu) sottu eccitazione indiretta, è FAA hè l'intensità di fluorescenza osservata in u canali accettatore (rossu) sottu eccitazione diretta ( PIE).I impulsi di intensità di fluorescenza sò osservati in u canali).
Posizionare 100 µl di soluzioni di reazione LLPS contenenti 25 µM Tau441 monomerico non etichettato (con o senza 25 µM αS) in tampone LLPS (supplementato come sopra) su micropiastre non vincolanti da 96 pozzetti con rivestimento in lamina adesiva e a formazione di gocce è stata verificata da microscopia WF. equilibriu.in 10 min.Dopu à 48 ore d'incubazione à a temperatura di l'ambienti, a prisenza di rafts di proteini è spots hè stata cunfirmata.Allora sguassate cù cura u liquidu nantu à i rafts da i pozzi, dopu aghjunghje 50 L di buffer di dissociazione (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) è incubate per 10 min.L'alta concentrazione di sali assicura chì LLPS ùn ripeterà micca per via di PEG residuale, è i pussibuli assemblei di proteini furmati solu da interazzione elettrostatica seranu disassemblati.U fondu di u pozzu hè stata cun cura cù una punta di micropipette è a suluzione resultanti hè stata trasferita à un pozzu d'osservazione viotu.Dopu incubazione di i campioni cù 50 μM ThT per 1 h, a presenza di spots isolati hè stata verificata da microscopia WF.Preparate fibrille αS sonicate incubando 300 µl di una soluzione αS 70-µM in PBS con pH 7,4, azoturo di sodio 0,01% a 37 °C e 200 rpm su un agitatore orbitale per 7 giorni.A suluzione hè stata poi centrifugata à 9600 × g per 30 min, u pellet hè statu risuspenditu in PBS pH 7,4 è sonicated (1 min, 50% cycle, 80% amplitude in un sonicator Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) campioni di fibrilla. cù una distribuzione di dimensioni relativamente uniforme di picculi fibrilli.
L'analisi FCS / FCCS è a rilevazione di coincidenza di dui culori (TCCD) sò state realizate nantu à u stessu microscopiu confocale fluorescente risoltu in u tempu MT200 (Pico-Quant, Berlin, Germania) utilizatu per l'esperimenti di microscopia FLIM-FRET utilizendu u modu PIE.A putenza laser per questi esperimenti hè stata aghjuntu à 6,0 µW (481 nm) è 6,2 µW (637 nm).A cumminazione di sti putenzi laser hè stata scelta per pruduce una luminosità simile per i coppie di fluorofori utilizati mentre ottene u tassi ottimali di conte è evitendu u photobleaching è a saturazione.Sia a raccolta di dati sia l'analisi sò stati realizati cù u software SymphoTime64 versione 2.3 (PicoQuant, Berlin, Germania).
Campioni di aggregati isolati αS/Tau ottenuti cù LLPS sò diluiti in un tampone d'isolazione à a cuncentrazione monomolecular appropritata (tipicamenti una diluzione 1: 500, postu chì l'aggregati sò digià à bassu concentrazioni quandu sò isolati da campioni di coacervate).I campioni sò stati applicati direttamente à i vetri (Corning, USA) precoated cù una suluzione BSA à una cuncentrazione di 1 mg/mL.
Per l'analisi PIE-smFRET in i canali verdi è rossi, una soglia di intensità più bassa di 25 fotoni hè stata applicata per filtrà i segnali di bassa intensità causati da eventi monomerici (nota chì i monomeri superanu i campioni aggregati cumparatu cù l'aggregati isolati).Questa soglia hè stata calculata cum'è cinque volte l'intensità media di αS monomerica ottenuta da l'analisi di campioni di monomeri puri per selezziunà specificamente aggregati per l'analisi.U circuitu di drive PIE, inseme cù l'acquisizione di dati TSCPC, hà permessu l'applicazione di un filtru di ponderazione per a vita chì aiuta à eliminà a diafonia di fondo è spettrale.L'intensità di flare selezziunata utilizendu i soglia di sopra hè stata corretta utilizendu u segnu di fondo mediu determinatu da l'istogrammi di l'occurrence versus l'intensità / bin di i campioni solu di buffer.Bursts assuciati cù grandi aggregati tipicamente occupanu parechji bins consecutivi in ​​a traccia di u tempu (impostatu à 1 ms).In questi casi, hè sceltu un bin di forza massima.Per l'analisi FRET è stoichiometric, u fattore gamma γ (0,517) hè statu utilizatu.A diafonia spettrale è i cuntributi di eccitazione diretta sò insignificanti (determinati sperimentalmente) à a putenza laser di eccitazione utilizata.L'efficienza è a stechiometria di FRET in una splusione hè calculata cum'è seguita.