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317 Fornitori di tubi in bobina in acciaio inox

Tavola di cumpusizioni chimica di materiale in acciaio inox

PACA6 hè una proteina di superficia espressa da sperma chì hè critica per a fusione di gameti durante a ripruduzzione sessuale di mammiferi.Malgradu stu rolu fundamentale, a funzione specifica di PACA6 hè pocu cumpresa.Elucidamu a struttura cristallina di u duminiu extracellulare di SPACA6 à una risoluzione di 2,2 Å, rivelando una proteina à dui domini composta da un fasciu di quattru filamenti è β-sandwich simili à Ig uniti da linkers quasi-flexibili.Sta struttura s'assumiglia à IZUMO1, un'altra proteina assuciata à a fusione di gameti, facendu SPACA6 è IZUMO1 membri fundatori di a superfamiglia di proteine ​​​​associate à a fecundazione chjamata quì sopra cum'è a superfamiglia IST.A superfamiglia IST hè strutturalmente definita da u so fasciu di quattru helix torciati è un paru di motivi CXXC disulfuri ligati.Una ricerca AlphaFold basata in struttura di u proteoma umanu identificò membri di proteini supplementari di sta superfamiglia;notevolmente, assai di sti proteini sò implicati in a fusione di gameti.A struttura SPACA6 è a so relazione cù l'altri membri di a superfamiglia IST furnisce u ligame mancante in a nostra cunniscenza di a fusione di gameti di mammiferi.
Ogni vita umana principia cù dui gameti aploidi separati: u sperma di u babbu è l'ovu di a mamma.Stu sperma hè u vincitore di un intensu prucessu di selezzione durante u quale milioni di cellule di sperma passanu per u trattu genitale femminile, superanu diversi ostaculi1 è sottumettenu a capacità, chì aumenta a so motilità è u prucessu di cumpunenti di a superficia2,3,4.Ancu s'è u sperma è l'ovocyte si trovanu, u prucessu ùn hè micca finitu.L'ovocyte hè circundatu da una strata di cellule cumulus è una barriera di glucoproteina chjamata zona pellucida, attraversu quale l'esperma deve passà per entre in l'ovocyte.I spermatozoi utilizanu una cumminazione di molécule di aderenza di a superficia è enzimi assuciati à a membrana è secreti per superà questi barrieri finali5.Queste molécule è enzimi sò principarmenti almacenati in a membrana interna è a matrice acrosomala è sò rilevati quandu a membrana esterna di u sperma hè lisata durante a reazione acrosomala6.L'ultimu passu in questu intensu viaghju hè l'avvenimentu di fusione di sperma-ovu, in quale e duie cellule fusionanu e so membrane per diventà un unicu urganismu diploide7.Ancu s'è stu prucessu hè rivoluzionariu in a ripruduzzione umana, l'interazzioni moleculari necessarii sò pocu capitu.
In più di a fecundazione di i gameti, a chimica di a fusione di dui lipidi bilayers hè stata largamente studiata.In generale, a fusione di a membrana hè un prucessu energeticamente sfavorevule chì esige un catalizzatore di prutezione per passà un cambiamentu di conformazione strutturale chì avvicina duie membrani, rompendu a so continuità è pruvucannu fusion8,9.Questi catalizzatori di prutezione sò cunnisciuti cum'è fusogeni è sò stati truvati in innumerevoli sistemi di fusione.Sò necessarii per l'ingressu virali in e cellule ospiti (per esempiu, gp160 in HIV-1, spike in coronaviruses, hemagglutinin in virus influenza)10,11,12 placentare (sincitina)13,14,15 è fusioni formanti gameti in eucarioti inferiori ( HAP2/GCS1 in piante, protisti è artropodi) 16,17,18,19.I fusogeni per i gameti umani anu da esse scupertu, ancu s'è parechje proteini sò stati dimustrati per esse critichi per l'attaccamentu di i gameti è a fusione.U CD9 espresso da ovociti, una proteina transmembrana necessaria per a fusione di gameti di mouse è umani, hè statu u primu à esse scupertu 21,22,23.Ancu s'è a so funzione precisa ùn hè micca chjaru, un rolu in l'adesione, a struttura di i fochi di aderenza nantu à i microvilli di l'ova, è / o a localizazione curretta di e proteine ​​​​superficiali di l'ovociti pari probabili 24,25,26.I dui proteini più tipici chì sò critichi per a fusione di gameti sò a proteina sperma IZUMO127 è a proteina ovocyte JUNO28, è a so associazione mutuale hè un passu impurtante in a ricunniscenza di gamete è l'adesione prima di a fusione.I topi knockout Izumo1 maschili è i topi knockout femminili Juno sò completamente sterili, in questi mudelli i sperma entra in u spaziu perivitellinu ma i gameti ùn si fusionanu.In listessu modu, a cunfluenza hè stata ridutta quandu i gameti sò stati trattati cù anticorpi anti-IZUMO1 o JUNO27,29 in esperimenti di fecundazione in vitro umanu.
Ricertamenti, hè statu scupertu un gruppu novu scupertu di proteine ​​​​espresse da sperma fenotipicamente simili à IZUMO1 è JUNO20,30,31,32,33,34,35.A proteina 6 associata à a membrana acrosomala di sperma (SPACA6) hè stata identificata cum'è essenziale per a fecundazione in un studiu di mutagenesi murina à grande scala.L'inserzione di u transgene in u genu Spaca6 produce spermatozoi nonfusible, anche si questi spermatozoi infiltranu u spaziu perivitellinu 36 .Studi di knockout successivi in ​​i topi cunfirmanu chì Spaca6 hè necessariu per a fusione di gameti 30,32.SPACA6 hè spressu quasi solu in i testiculi è hà un mudellu di localizazione simili à quellu di IZUMO1, vale à dì in l'intima di i spermatozoi prima di a reazione acrosomala, è poi migra à a regione equatoriale dopu a reazione acrosomala 30,32.Spaca6 homologues esistenu in una varietà di mammiferi è altri eucarioti 30 è a so impurtanza per a fusione di gameti umani hè stata dimustrata da l'inibizione di a fertilizazione umana in vitro da a resistenza à SPACA6 30 .A cuntrariu di IZUMO1 è JUNO, i dettagli di a struttura, l'interazzione è a funzione di PACA6 ùn sò micca chjaru.
Per capisce megliu u prucessu fundamentale sottu à a fusione di u sperma umanu è l'ova, chì ci permetterà di informà i futuri sviluppi in a pianificazione di a famiglia è u trattamentu di a fertilità, avemu realizatu studii strutturali è biochimici PACA6.A struttura cristallina di u duminiu extracellulare di SPACA6 mostra un fasciu di quattru elica (4HB) è un duminiu immunoglobulina (Ig-like) cunnessu da regioni quasi flessibili.Cum'è previstu in studii precedenti, 7,32,37 a struttura di u duminiu di SPACA6 hè simile à quella di l'IZUMO1 umanu, è e duie proteine ​​​​spartenu un motivu inusual: 4HB cù una superficia elicoidale triangulare è un paru di motivi CXXC disulfide-linked.Avemu prupostu chì IZUMO1 è SPACA6 definenu avà una superfamiglia più grande, strutturalmente ligata di proteine ​​​​associate à a fusione di gameti.Utilizendu caratteristiche uniche di a superfamiglia, avemu realizatu una ricerca exhaustiva per u proteoma umanu strutturale AlphaFold, identificendu membri supplementari di sta superfamiglia, cumprese parechji membri implicati in a fusione di gameti è / o fertilizazione.Avà pare chì ci hè una piega strutturale cumuna è una superfamiglia di proteine ​​​​associate à a fusione di gameti, è a nostra struttura furnisce una mappa moleculare di questu aspettu impurtante di u mecanismu di fusione di gameti umani.
SPACA6 hè una proteina transmembrana à un passaghju cù un glycan N-linked è sei putativi disulfuri bonds (Figure S1a è S2).Avemu spressu u duminiu extracellular di SPACA6 umanu (residues 27-246) in Drosophila S2 cells è purificatu a proteina cù l'affinità di nickel, u scambiu di cationi è a cromatografia d'esclusione di taglia (Fig. S1b).L'ectodomain SPACA6 purificatu hè assai stabile è homogeni.L'analisi cù a cromatografia d'esclusione di taglia cumminata cù a dispersione di luce poligonale (SEC-MALS) hà revelatu un piccu cun un pesu moleculare calculatu di 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Questu hè coherente cù a dimensione di l'ectodomain monomericu SPACA6, chì indica chì l'oligomerizazione ùn hè micca accaduta durante a purificazione.Inoltre, a spettroscopia di dicroismu circular (CD) palesa una struttura α / β mixta cù un puntu di fusione di 51,3 ° C (Fig. S1d, e).La déconvolution des spectres CD a révélé 38,6 % d'éléments α-hélicoïdaux et 15,8 % d'éléments à brin β (Figure S1d).
L'ectodomain SPACA6 hè statu cristallizatu utilizendu una matrice aleatoria seeding38 risultatu in un settore di dati cù una risoluzione di 2.2 Å (Tabella 1 è Figura S3).Utilizendu una cumminazione di sustituzione moleculare basata in frammenti è dati di phasing SAD cù l'esposizione di bromu per a determinazione di a struttura (Tabella 1 è Figura S4), u mudellu raffinatu finali hè custituitu da residui 27-246.À u mumentu chì a struttura hè stata determinata, ùn ci era micca strutture sperimentali o AlphaFold dispunibili.L'ectodomain SPACA6 misura 20 Å × 20 Å × 85 Å, hè custituitu di sette hélices è nove β-strands, è hà un terciariu allungatu stabilizatu da sei ligami disulfide (Fig. 1a, b).A densità di l'elettroni debbuli à a fine di a catena laterale Asn243 indica chì stu residuu hè una glicosilazione N-ligata.A struttura hè custituita da dui duminii: un bundle N-terminal four-helix (4HB) è un duminiu C-terminal Ig-like cun una regione hinge intermediate trà elli (Fig. 1c).
a Struttura di u duminiu extracellulare di PACA6.Diagramma di striscia di u duminiu extracellulare di SPACA6, u culore di a catena da N à C-terminale da blu scuru à rossu scuru.Le cisteine ​​implicate nei legami disulfuri sono evidenziate in magenta.b Topulugia di u duminiu extracellular di PACA6.Aduprate u listessu schema di culore cum'è in Figura 1a.c Dominiu extracellulare PACA6.I grafici di striscia di domini 4HB, cerniera è Ig-like sò culurati aranciu, verde è blu, rispettivamente.I strati ùn sò micca disegnati à scala.
U duminiu 4HB di SPACA6 include quattru hélices principali (hélices 1-4), chì sò disposti in forma di una helix helix (Fig. 2a), alternante trà interazzioni antiparalleli è paralleli (Fig. 2b).Una piccula helix addiziale di una sola volta (helix 1′) hè posta perpendiculare à u fasciu, furmendu un triangulu cù l'elice 1 è 2. Stu triangulu hè ligeramente deformatu in u pacchettu helical-twisted di u pacchettu relativamente densu di l'elice 3 è 4 ( Fig. 2a).
Graficu di striscia N-terminale 4HB.b Vista superiore di un fasciu di quattru hélices, ogni helix evidenziata in blu scuru à u N-terminale è rossu scuru à u C-terminale.c Diagramma di rota in spirale in cima per 4HB, cù ogni residuu indicatu cum'è un cerculu marcatu cù un codice d'aminoacidu di una sola lettera;solu i quattru aminoacidi in cima di a rota sò numerati.I residui non polari sò culurati gialli, i residui polari senza carica sò culurati verdi, i residui caricati positivamente sò culurati in blu, è i residui caricati negativamente sò culurati rossi.d Facce triangulari di u duminiu 4HB, cù 4HBs in aranciu è cerniere in verde.I dui inserti mostranu legami disulfuri in forma di bastone.
4HB hè cuncintratu nantu à un core idrofobicu internu cumpostu principalmente di residui alifatici è aromatichi (Fig. 2c).U core cuntene un ligame disulfide trà Cys41 è Cys55 chì liga l'elice 1 è 2 inseme in un triangulu elevatu superiore (Fig. 2d).Dui ligami disulfuri supplementari sò stati formati trà u motivu CXXC in Helix 1 'è un altru motivu CXXC truvatu à a punta di u β-hairpin in a regione hinge (Fig. 2d).Un residuu di arginina cunservatore cù una funzione sconosciuta (Arg37) si trova in un triangulu cavo furmatu da l'elice 1′, 1 è 2. Atomi di carbonu alifatici Cβ, Cγ è Cδ Arg37 interagiscono cù u nucleu idrofobicu, è i so gruppi guanidine si movenu ciclicamente. trà hélices 1' è 1 via interazzione trà a spina Thr32 è a catena laterale (Fig. S5a, b).Tyr34 si estende in a cavità lascendu duie cavità chjuche attraversu quale Arg37 pò interagisce cù u solvente.
I duminii β-sandwich simili à Ig sò una grande superfamiglia di proteine ​​​​chì sparte a caratteristica cumuna di dui o più fogli β anfipati multifilari chì interagiscenu per mezu di un core idrofobu 39. U duminiu C-terminale Ig-like di SPACA6 hà u listessu mudellu. è custituitu di dui strati (Fig. S6a).Sheet 1 hè una β-foglia di quattru brins (brins D, F, H, è I) induve i brins F, H è I formanu una disposizione anti-parallela, è i brins I è D piglianu una interazzione parallela.U tavulu 2 hè una piccula foglia beta à doppia fila antiparallela (fili E è G).Un ligame disulfide internu hè statu osservatu trà u C-terminale di a catena E è u centru di a catena H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Stu ligame disulfuru hè analogu à u ligame disulfuru in u duminiu β-sandwich di l'immunoglobulina40,41.
U fogliu β à quattru brins si torce in tutta a so lunghezza, formando bordi asimmetrici chì si differenzianu in forma è elettrostatica.U thinner edge hè una superficia ambientale idrofobica piatta chì si distingue cumparatu cù e superfici irregolari è electrostatically diverse in PACA6 (Fig. S6b, c).Un halo di gruppi carbonili / amino di spina esposta è catene laterali polari circundanu a superficia idrofobica (Fig. S6c).U marghjenu più largu hè cupartu da un segmentu helical capped chì blucca a parte N-terminale di u core hydrophobic è formate trè ligami d'idrogenu cù u gruppu polare apertu di a spina di a catena F (Fig. S6d).A porzione C-terminale di stu bordu forma una grande tasca cù un core idrofobicu parzialmente esposto.A sacchetta hè circundatu di carichi pusitivi per trè gruppi di residui di arginina doppia (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 è Arg212-Arg214) è una istidina centrale (His220) (Figura S6e).
A regione di cerniera hè un segmentu breve trà u duminiu helical è u duminiu Ig-like, custituitu da una β-layer antiparallele à trè brins (brinamenti A, B è C), una piccula helix 310, è parechji segmenti helical aléatoires longs.(Fig. S7).Una reta di cuntatti covalenti è elettrostatici in a regione cerniera pare stabilizzà l'orientazione trà 4HB è u duminiu Ig-like.A reta pò esse divisa in trè parti.La première partie comprend deux motifs CXXC (27CXXC30 et 139CXXC142) qui forment une paire de liaisons disulfures entre l'épingle à cheveux β dans la charnière et l'hélice 1' en 4HB.A seconda parte include interazioni elettrostatiche trà u duminiu Ig-like è a cerniera.Glu132 in a cerniera forma un ponte di sali cù Arg233 in u duminiu Ig-like è Arg135 in a cerniera.A terza parte include un ligame covalente trà u duminiu Ig-like è a regione cerniera.Dui ligami disulfuri (Cys124-Cys147 è Cys128-Cys153) cunnetta u ciclu di cerniera à un ligame chì hè stabilizatu da interazzioni elettrostatiche trà Gln131 è u gruppu funziunale di spine, chì permettenu l'accessu à u primu duminiu Ig-like.catena.
A struttura di l'ectodomain PACA6 è e strutture individuali di i domini 4HB è Ig-like sò stati utilizati per ricercà registri strutturalmente simili in basa di dati di prutezione 42 .Avemu identificatu partiti cù punteggi elevati Dali Z, picculi deviazioni standard è grandi punteggi LALI (questi ultimi sò u numeru di residui strutturalmente equivalenti).Mentre chì i primi 10 hits da a ricerca completa di l'ectodomain (Table S1) avianu un Z-score accettabile di> 842, una ricerca per u duminiu 4HB o Ig-like solu hà dimustratu chì a maiò parte di sti successi currispondenu à β-sandwiches solu.una piega omnipresente truvata in parechje proteini.Tutti i trè ricerchi in Dali riturnò solu un risultatu: IZUMO1.
Hè statu longu suggeritu chì SPACA6 è IZUMO1 sparte similarità strutturali7,32,37.Ancu s'è l'ectodomini di sti dui proteini associati à a fusione di gameti sparte solu l'identità di sequenza di 21% (Figura S8a), l'evidenza cumplessa, cumpresu un mudellu di legame disulfuru cunservatu è un duminiu C-terminale Ig-like previstu in SPACA6, hà permessu i primi tentativi di custruisce un mudellu d'omulugia di A un mouse SPACA6 utilizendu IZUMO1 cum'è mudellu37.A nostra struttura cunfirma sti predizioni è mostra u veru gradu di similitudine.In fattu, e strutture SPACA6 è IZUMO137,43,44 sparte a listessa architettura di dui domini (Fig. S8b) cù duminii simili 4HB è Ig-like β-sandwich cunnessi da una regione cerniera (Fig. S8c).
IZUMO1 è PACA6 4HB anu diffirenzii cumuni da i fasci spirali convenzionali.4HBs tipici, cum'è quelli chì si trovanu in i complexi di proteini SNARE implicati in a fusione endosomala 45,46, anu hélices uniformemente spaziati chì mantenenu una curvatura constante intornu à un assi cintrali 47. In cuntrastu, i duminii helical in i dui IZUMO1 è SPACA6 eranu distorti, cù curvatura variabile è imballaggio irregolare (Figura S8d).A torsione, prubabilmente causata da u triangulu furmatu da l'elice 1′, 1 è 2, hè ritenuta in IZUMO1 è SPACA6 è stabilizzata da u stessu motivu CXXC nantu à l'helix 1′.In ogni casu, u ligame disulfuru supplementu truvatu in SPACA6 (Cys41 è Cys55 covalently linking helices 1 and 2 above) crea un apex più sharper à l'apex triangulu, facendu SPACA6 più torciatu di IZUMO1, cù trianguli di cavità più pronunzianu.Inoltre, IZUMO1 manca Arg37 osservatu in u centru di sta cavità in SPACA6.Al contrario, IZUMO1 ha un nucleo idrofobico più tipico di residui alifatici e aromatici.
L'IZUMO1 a un domaine Ig-like constitué d'un β-sheet à double brin et à cinq brins43.U filu extra in IZUMO1 rimpiazza a bobina in SPACA6, chì interagisce cù u filu F per limità i ligami di l'idrogenu di a spina in u filu.Un puntu interessante di paraguni hè a carica di a superficia prevista di i domini Ig-like di e duie proteine.A superficia IZUMO1 hè più carica negativamente cà a superficia PACA6.Una carica addiziale hè situata vicinu à u C-terminale di fronte à a membrana sperma.In SPACA6, i stessi rigioni eranu più neutrali o pusitivi (Fig. S8e).Per esempiu, a superficia idrofobica (bordi più sottili) è i pozzi caricati positivamente (bordi più largu) in SPACA6 sò caricati negativamente in IZUMO1.
Ancu s'è a relazione è l'elementi di a struttura secundaria trà IZUMO1 è SPACA6 sò ben cunsirvati, l'allinamentu strutturale di i duminii Ig-like dimustrava chì i dui duminii differ in a so orientazione generale relative à l'altri (Fig. S9).U fasciu spirale di IZUMO1 hè curvatu annantu à u β-sandwich, creendu a forma di "boomerang" descritta prima à circa 50 ° da l'assi cintrali.In cuntrastu, u fasciu elicoidale in PACA6 hè stata inclinata di circa 10 ° in a direzzione opposta.E differenze in queste orientazioni sò prubabilmente dovute à e differenze in a regione di a cerniera.À u livellu di sequenza primaria, IZUMO1 è SPACA6 sparte pocu similitudine di sequenza à a cerniera, cù l'eccezzioni di cisteina, glicina è residui di l'acidu asparticu.In u risultatu, i ligami di l'idrogenu è e rete elettrostatiche sò completamente diffirenti.L'elementi di struttura secundaria di β-sheet sò spartuti da IZUMO1 è SPACA6, ancu s'è e catene in IZUMO1 sò assai più longu è l'helix 310 (helix 5) hè unica à SPACA6.Queste differenze risultanu in diverse orientazioni di duminiu per duie proteine ​​altrimenti simili.
A nostra ricerca di u servitore Dali hà revelatu chì SPACA6 è IZUMO1 sò l'unicu dui strutture determinate sperimentalmente almacenate in a basa di dati di a proteina chì anu stu particulare 4HB fold (Table S1).Più recentemente, DeepMind (Alphabet/Google) hà sviluppatu AlphaFold, un sistema basatu in a rete neurale chì pò predice accuratamente e strutture 3D di proteine ​​​​da sequenze primarie48.Pocu dopu avemu risoltu a struttura PACA6, a basa di dati AlphaFold hè stata liberata, chì furnisce mudelli di struttura predittiva chì copre u 98.5% di tutte e proteine ​​​​in u proteoma umanu48,49.Utilizendu a nostra struttura SPACA6 risolta cum'è un mudellu di ricerca, una ricerca di l'omologia strutturale per u mudellu in u proteoma umanu AlphaFold identificò candidati cù pussibuli similitudini strutturali à SPACA6 è IZUMO1.Data l'incredibile precisione di AlphaFold in predicting SPACA6 (Fig. S10a) - in particulare l'ectodomain 1.1 Å rms paragunatu à a nostra struttura risolta (Fig. S10b) - pudemu esse cunfidenti chì i partiti SPACA6 identificati sò prubabilmente precisi.
Precedentemente, PSI-BLAST cercava u cluster IZUMO1 cù trè altre proteine ​​​​associate à u sperma: IZUMO2, IZUMO3 è IZUMO450.AlphaFold hà previstu chì sti proteini di a famiglia IZUMO si piegate in u duminiu 4HB cù u listessu mudellu di legame disulfuru cum'è IZUMO1 (Figure 3a è S11), ancu s'ellu mancanu un duminiu Ig-like.Hè ipotisatu chì IZUMO2 è IZUMO3 sò proteini di membrana unilaterali simili à IZUMO1, mentri IZUMO4 pare esse secretatu.E funzioni di i proteini IZUMO 2, 3 è 4 in a fusione di gameti ùn sò micca stati determinati.IZUMO3 hè cunnisciutu di ghjucà un rolu in a biogenesi di l'acrosomi durante u sviluppu di i spermatozoi51, è a proteina IZUMO forma un cumplessu50.A cunservazione di e proteini IZUMO in mammiferi, rettili è anfibi suggerisce chì a so funzione potenziale hè coherente cù quella di altre proteine ​​​​associate à a fusione di gameti cunnisciuti, cum'è DCST1/2, SOF1 è FIMP.
Diagramma di l'architettura di u duminiu di a superfamiglia IST, cù domini 4HB, cerniera è Ig-like evidenziati in aranciu, verde è blu, rispettivamente.IZUMO4 hà una regione C-terminale unica chì pare nera.I ligami disulfuri cunfirmati è putativi sò indicati da linee solidi è punti, rispettivamente.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1), è AlphaFEM95 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) sò visualizati in a listessa gamma di culori cum'è u pannellu A. I ligami disulfuri sò mostrati in magenta.L'elice transmembrana TMEM95, IZUMO2 è IZUMO3 ùn sò micca mostrati.
A cuntrariu di a proteina IZUMO, altri proteini SPACA (ie, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 è SPACA9) sò pensati à esse strutturalmente sfarente da SPACA6 (Fig. S12).Solu SPACA9 hà 4HB, ma ùn hè micca previstu d'avè a listessa orientazione parallela-anti-parallela o u stessu ligame disulfuru cum'è SPACA6.Solu SPACA1 hà un duminiu simili à Ig.AlphaFold predice chì SPACA3, SPACA4 è SPACA5 anu una struttura completamente diversa da SPACA6.Curiosamente, SPACA4 hè ancu cunnisciutu di ghjucà un rolu in a fecundazione, ma in una misura più grande di SPACA6, invece di facilità l'interazzione trà u sperma è l'ovocyte zona pellucida52.
A nostra ricerca AlphaFold hà truvatu un altru match per IZUMO1 è SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, una sola proteina transmembrana specifica di sperma, rende i topi maschili sterili quandu sò ablati 32,33.Les spermatozoïdes dépourvus de TMEM95 avaient une morphologie normale, une mobilité et une capacité à pénétrer dans la zone pellucide et à se lier à la membrane de l'œuf, mais ne pouvaient pas fusionner avec la membrane de l'ovocyte.Studi precedenti anu dimustratu chì TMEM95 sparte similitudini strutturali cù IZUMO133.Infatti, u mudellu AlphaFold hà cunfirmatu chì TMEM95 hè un 4HB cù u stessu paru di motivi CXXC cum'è IZUMO1 è SPACA6 è u stessu ligame disulfuru supplementu trà l'heli 1 è 2 truvati in SPACA6 (Fig. 3a è S11).Ancu s'ellu TMEM95 ùn manca un duminiu Ig-like, hà una regione cù un mudellu di disulfide bond similar to the SPACA6 and IZUMO1 hinge regions (Fig. 3b).A l'ora di a publicazione di stu manuscrittu, u servitore di preprint hà infurmatu a struttura di TMEM95, cunfirmendu u risultatu AlphaFold53.TMEM95 hè assai simili à SPACA6 è IZUMO1 è hè evolutivamente cunservatu digià in anfibii (Fig. 4 è S13).
A ricerca PSI-BLAST hà utilizatu a basa di dati NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP è SOF1 per determinà a pusizione di sti sequenze in l'arbre di vita.I distanzi trà i punti di ramu ùn sò micca indicati à scala.
L'impressionante similitude strutturale generale trà SPACA6 è IZUMO1 suggerisce chì sò membri fundatori di una superfamiglia strutturale cunservata chì include e proteine ​​​​TMEM95 è IZUMO 2, 3 è 4.membri cunnisciuti: IZUMO1, SPACA6 è TMEM95.Perchè solu uni pochi membri pussede domini Ig-like, u segnu distintivu di a superfamiglia IST hè u duminiu 4HB, chì hà caratteristiche uniche cumune à tutte sti proteini: 1) 4HB Coiled cù elici disposti in una alternanza anti-parallela / parallela (Fig. . 5a), 2) u fasciu hà una faccia triangulare custituita da duie hélices in u fasciu è una terza helix verticale (Fig. zona chjave (Fig. 5c). U mutivu CXXC, truvatu in proteini simili à tioredoxina, hè cunnisciutu di funziunà. cum'è un sensor redox 54,55,56, mentri u mutivu in i membri di a famiglia IST pò esse assuciatu cù isomerasi di disulfide di proteina, cum'è ERp57 in gamete fusion.
I membri di a superfamiglia IST sò definite da trè caratteristiche caratteristiche di u duminiu 4HB: quattru hélices alternanu trà l'orientazione parallela è antiparallela, facci di fasciu helical ba-triangulari, è un mutivu doppiu ca CXXC furmatu trà picculi molécules.) Hélices N-terminales (orange) et région charnière β-épingle à cheveux (vert).
Data a similitudine trà SPACA6 è IZUMO1, a capacità di l'anzianu di ligà à IZUMO1 o JUNO hè stata pruvata.L'interferometria di Biolayer (BLI) hè un metudu di legame basatu in cinetica chì hè stata utilizata prima per quantificà l'interazzione trà IZUMO1 è JUNO.Dopu l'incubazione di u sensoru marcatu di biotina cù IZUMO1 cum'è un esca cù una alta concentrazione di analite JUNO, un signalu forte hè statu rilevatu (Fig. S14a), chì indicanu un cambiamentu induvatu da ubligatoriu in u gruixu di u biomaterial attaccatu à a punta di u sensoru.Segnali simili (ie, JUNO accoppiatu à u sensoru cum'è un esca contru IZUMO1 analyte) (Fig. S14b).Nisun signalu hè statu rilevatu quandu SPACA6 hè stata utilizata com'è analite contr'à IZUMO1 o JUNO ligatu à u sensoru (Figura S14a,b).L'absenza di stu signale indica chì u duminiu extracellulare di SPACA6 ùn interagisce micca cù u duminiu extracellular di IZUMO1 o JUNO.
Perchè l'assay BLI hè basatu annantu à a biotinilazione di residui di lisina libera nantu à a proteina di l'esca, sta mudificazione pò prevene u ligame se i residui di lisina sò implicati in l'interazzione.Inoltre, l'orientazione di u ligame relative à u sensoru pò creà ostaculi sterichi, cusì i saggi di pull-down cunvinziunali sò stati ancu realizati nantu à l'ectodomini SPACA6, IZUMO1 è JUNO recombinante.Malgradu questu, SPACA6 ùn hà micca precipitatu cù His-tagged IZUMO1 o His-tagged JUNO (Fig. S14c, d), chì indicanu nisuna interazzione coherente cù quellu osservatu in esperimenti BLI.Cum'è un cuntrollu pusitivu, avemu cunfirmatu l'interazzione di JUNO cù l'etichetta His IZUMO1 (Figures S14e è S15).
Malgradu a similitudine strutturale trà SPACA6 è IZUMO1, l'incapacità di SPACA6 di ligà JUNO ùn hè micca surprisante.A superficia di l'IZUMO1 umanu hà più di 20 residues chì interaccettanu cù JUNO, cumpresi i residui di ognuna di e trè regioni (ancu a maiò parte di elli si trovanu in a regione cerniera) (Fig. S14f).Di sti residui, solu unu hè cunsirvatu in PACA6 (Glu70).Mentre chì parechji sustituzioni di residuu conservavanu e so proprietà biochimiche originali, u residuu essenziale di Arg160 in IZUMO1 hè statu rimpiazzatu da l'Asp148 carica negativamente in SPACA6;studii precedenti anu dimustratu chì a mutazione Arg160Glu in IZUMO1 abolisce quasi cumplitamenti ubligatoriu à JUNO43.Inoltre, a diffarenza di l'orientazione di u duminiu trà IZUMO1 è SPACA6 hà aumentatu significativamente a superficia di u situ JUNO-binding di a regione equivalente in SPACA6 (Fig. S14g).
Malgradu a necessità cunnisciuta di SPACA6 per a fusione di gameti è a so similitudine cù IZUMO1, SPACA6 ùn pare micca avè una funzione di ubligatoriu JUNO equivalente.Dunque, avemu cercatu di cumminà i nostri dati strutturali cù evidenza di impurtanza furnita da a biologia evolutiva.L'allineamentu di sequenza di l'omologi di PACA6 mostra a cunservazione di a struttura cumuna oltre i mammiferi.Per esempiu, i residui di cisteina sò prisenti ancu in anfibii distanti (Fig. 6a).Utilizendu u servitore ConSurf, i dati di retenzioni di l'allineamentu di sequenze multiple di 66 sequenze sò stati mappati à a superficia SPACA6.Stu tipu d'analisi pò dimustrà quali residui sò stati cunservati durante l'evoluzione di a proteina è ponu indicà chì e regioni di a superficia ghjucanu un rolu in a funzione.
un Allineamentu di Sequenza di ectodominii PACA6 da 12 spezie diverse preparate cù CLUSTAL OMEGA.Sicondu l'analisi ConSurf, i posti più cunsirvatori sò marcati in blu.I residui di cisteina sò evidenziati in rossu.Les limites du domaine et les éléments de structure secondaire sont indiqués en haut de l'alignement, où les flèches indiquent les brins β et les ondes indiquent les hélices.L'identificatori d'accessu NCBI chì cuntenenu e sequenze sò: umanu (Homo sapiens, NP_001303901), mandrillo (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), scimmia capucinu (Cebus mimic, XP_017359366), cavallu (Equus caballus), (Equus caballus, XP_0102350, killer 0102350) XP_032_034) .), pecora (Ovis aries, XP_014955560), elefante (Loxodonta africana, XP_010585293), cane (Canis lupus familyis, XP_025277208), topo (Mus musculus, NP_001156381), diavolo di Tasmania (Sarpi1, XP_8, XP_03), 8) , 61_89 è Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).A numerazione hè basatu annantu à l'ordine umanu.b Rappresentazione di a superficia di a struttura SPACA6 cù 4HB à a cima è u duminiu Ig-like in u fondu, culori basati nantu à stimi di cunservazione da u servitore ConSurf.I più boni cunservati sò in blu, i pezzi moderatamente cunservati sò in biancu, è i menu cunservati sò in giallu.cisteina viola.Trè patch di superficia chì dimustranu un altu livellu di prutezzione sò mostrati in l'inseritu etichettati patches 1, 2 è 3. Un cartoon 4HB hè mostratu in l'inseritu in cima à diritta (stessu schema di culore).
A struttura PACA6 hà trè rigioni di superficia altamente cunservata (Fig. 6b).Patch 1 spans 4HB and the hinge region and contains two conservated CXXC disulfide bridges, an Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 hinge network (Fig. S7), and three conservated outside aromatic residues (Phe31, Tyr73, Phe137)).un rimu più largu di u duminiu Ig-like (Fig. S6e), chì rapprisenta parechji residui pusitivi di carica nantu à a superficia di sperma.Curiosamente, stu patch cuntene un epitope d'anticorpu chì hè statu dimustratu prima chì interferiscenu cù a funzione PACA6 30.Regione 3 spans the hinge and one side of the Ig-like domain;sta regione cuntene proline conservati (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) è residui polari / caricati rivolti à l'esterno.Sorprendentemente, a maiò parte di i residui nantu à a superficia di 4HB sò assai variàbbili (Fig. 6b), ancu s'è u fold hè cunsirvatu in tuttu l'omologu SPACA6 (cum'è indicatu da u cunservatorismu di u core di fasciu idrofobicu) è fora di a superfamiglia IST.
Bien qu'il s'agisse de la plus petite région de SPACA6 avec le moins d'éléments de structure secondaire détectables, de nombreux restes de régions charnières (incluant la région 3) sont très conservés parmi les homologues de SPACA6, ce qui peut indiquer que l'orientation du faisceau hélicoïdal et du β-sandwich joue un rôle.cum'è cunservatore.In ogni casu, malgradu un vastu ligame di l'idrogenu è e rete elettrostatiche in a regione di cerniera di SPACA6 è IZUMO1, l'evidenza di flessibilità intrinseca pò esse vistu in l'allineamentu di e multiple strutture permesse di IZUMO137,43,44.L'alineazione di i duminii individuali si superponu bè, ma l'orientazione di i duminii relative à l'altri variò da 50 ° à 70 ° da l'assi cintrali (Fig. S16).Per capiscenu a dinamica conformational di SPACA6 in suluzione, esperimenti SAXS sò stati realizati (Fig. S17a, b).Ab initio reconstruction of the SPACA6 ectodomain conformed to a rod crystal structure (Fig. S18), ancu s'è u Kratky plot mustrò un certu gradu di flessibilità (Fig. S17b).Sta cunfurmazione cuntrasta cù IZUMO1, in quale a proteina unbound assume una forma di boomerang sia in u lattice sia in suluzione43.
Per identificà specificamente a regione flexible, a spettroscopia di massa di scambiu d'idrogenu-deuterium (H-DXMS) hè stata realizata nantu à SPACA6 è paragunata cù e dati ottenuti prima nantu à IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 hè chjaramente più flexible chì IZUMO1, cum'è indicatu da un scambiu di deuterium più altu in tutta a struttura dopu à 100 000 s di scambiu.In e duie strutture, a parte C-terminale di a regione cerniera mostra un altu livellu di scambiu, chì prubabilmente permette una rotazione limitata di domini 4HB è Ig-like relative à l'altri.Curiosamente, a parte C-terminale di a cerniera SPACA6, custituita da u residuu 147CDLPLDCP154, hè una regione altamente cunservata 3 (Fig. 6b), possibbilmente indicà chì a flessibilità interdomaine hè una caratteristica evolutivamente conservata di SPACA6.Sicondu l'analisi di flessibilità, CD termale melt data dimustratu chì SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) hè menu stabile di IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) (Fig. S1e è S19).
a H-DXMS images di SPACA6 è b IZUMO1.U percentualità di scambiu di deuterium hè stata determinata à i punti di tempu indicati.I livelli di scambiu di l'idrogenu-deuterium sò indicati da u culore nantu à una scala gradiente da u blu (10%) à u rossu (90%).I scatuli neri rapprisentanu spazii d'altu scambiu.I cunfini di 4HB, cerniera è duminiu Ig-like osservati in a struttura cristallina sò mostrati sopra à a sequenza primaria.I livelli di scambiu di Deuterium à 10 s, 1000 s, è 100 000 s sò stati tracciati nantu à un graficu di striscia sovrapposta à e superfici molecolari trasparenti di SPACA6 è IZUMO1.E parti di strutture cù un livellu di scambiu di deuterium sottu à 50% sò culurati bianchi.I zoni sopra u 50% di u scambiu H-DXMS sò culurati in una scala di gradiente.
L'usu di CRISPR / Cas9 è strategie genetiche di knockout di u genu di u mouse hà purtatu à l'identificazione di parechji fatturi impurtanti per u ligame è a fusione di sperma è ovu.In più di l'interazzione ben carattarizata di a struttura IZUMO1-JUNO è CD9, a maiò parte di e proteine ​​​​associate à a fusione di gameti restanu strutturalmente è funziunali enigmatici.A carattarizazione biofisica è strutturale di SPACA6 hè un altru pezzu di u puzzle moleculare di aderenza / fusione durante a fecundazione.
SPACA6 è altri membri di a superfamiglia IST parevanu assai cunsirvati in i mammiferi è in l'uccelli individuali, i rettili è l'anfibii;in fatti, hè pensatu chì SPACA6 hè ancu necessariu per a fecundazione in zebrafish 59. Questa distribuzione hè simile à l'altri proteini cunnisciuti associati à a fusione di gameti cum'è DCST134, DCST234, FIMP31 è SOF132, chì suggerenu chì questi fattori sò HAP2-deficient (ancu. cunnisciuti cum'è GCS1) proteini chì sò rispunsevuli di l'attività catalitica di parechji protisti., piante è artropodi.Proteini di fusione fertilizati 60, 61. Malgradu a forte similitudine strutturale trà SPACA6 è IZUMO1, knockout di genes chì codificanu una di queste proteini hà risultatu in infertilità in i topi maschili, chì indicanu chì e so funzioni in a fusione di gameti ùn sò micca duplicati..In modu più generale, nimu di e proteine ​​​​di sperma cunnisciute necessarie per a fase di aderenza di a fusione hè redundante.
Resta una quistione aperta se SPACA6 (è altri membri di a superfamiglia IST) participanu à junctions intergametic, formanu rete intragametiche per reclutà proteine ​​​​impurtanti à i punti di fusione, o forse ancu agisce cum'è fusogens sfuggenti.Studi di co-immunoprecipitazione in e cellule HEK293T anu revelatu una interazzione trà IZUMO1 di lunghezza completa è SPACA632.Tuttavia, i nostri ectodomini recombinanti ùn anu micca interazzione in vitro, chì suggerenu chì l'interazzione vistu in Noda et al.eranu tramindui sguassati in a custruzzione (nota a cuda citoplasmatica di IZUMO1, chì hè statu dimustratu chì ùn hè micca necessariu per a fertilizazione62).In alternativa, IZUMO1 è / o SPACA6 ponu esse bisognu di ambienti specifichi di ubligatoriu chì ùn avemu micca riproduce in vitro, cum'è cunfurmazioni fisiologicamente specifiche o cumplessi molecolari chì cuntenenu altre proteini (cunnisciutu o micca scupertu).Ancu s'ellu si crede chì l'ectodomain IZUMO1 mediate l'attaccamentu di i spermatozoi à l'ovu in u spaziu perivitellinu, u scopu di l'ectodomain SPACA6 ùn hè micca chjaru.
A struttura di PACA6 palesa parechje superfici cunservate chì ponu esse implicati in interazzione proteina-proteina.A parte cunservata di a regione di cerniera immediatamente adiacente à u motivu CXXC (designatu Patch 1 sopra) hà parechji residui aromatici rivolti à l'esterno chì sò spessu associati cù interazioni idrofobiche è π-stacking trà biomolecule.I lati larghi di u duminiu Ig-like (regione 2) formanu un groove caricatu pusitivu cù Arg è His residui altamente conservati, è l'anticorpi contr'à sta regione sò stati utilizati prima per bluccà a fusione di gameti 30 .L'anticorpu ricunnosce l'epitope lineale 212RIRPAQLTHRGTFS225, chì hà trè di i sei residui di arginina è His220 altamente cunservatu.Ùn hè micca chjaru se a disfunzione hè dovuta à u bloccu di sti residui specifichi o a regione sana.U locu di sta lacuna vicinu à u C-terminale di u β-sandwich indica cis-interazzione cù e proteine ​​​​di spermatozoi vicini, ma micca cù e proteine ​​​​ovocyte.Inoltre, a ritenzione di un tangle riccu di proline altamente flexible (situ 3) in a cerniera pò esse u situ di una interazzione proteina-proteina o, più prubabilmente, indicà a ritenzione di flessibilità trà i dui duminii.U genere hè impurtante per u rolu scunnisciutu di PACA6.fusione di gameti.
PACA6 hà proprietà di proteine ​​​​di adesione intercellulare, cumprese i β-sandwich simili à Ig.Parechje proteini adesivi (per esempiu, cadherine, integrine, adesine è IZUMO1) pussedenu unu o più duminii β-sandwich chì estendenu e proteine ​​​​da a membrana cellulare à i so miri ambientali63,64,65.Le domaine Ig-like de SPACA6 contient également un motif que l'on trouve communément dans les β-sandwichs d'adhérence et de cohésion : doublets de brins parallèles aux extrémités des β-sandwiches, connus sous le nom de pinces mécaniques66.Hè cresce chì stu mutivu aumenta a resistenza à e forze di cisura, chì hè preziosa per i proteini implicati in l'interazzione intercellular.In ogni casu, malgradu sta similitudine à l'adhesini, ùn ci hè attualmente alcuna evidenza chì SPACA6 interagisce cù i bianchi d'ova.L'ectodomain SPACA6 ùn hè micca capaci di ligà à JUNO, è e cellule HEK293T chì esprimenu SPACA6, cum'è mostra quì, pocu interagisce cù ovociti chì mancanu a zona 32.Se PACA6 stabilisce ligami intergametichi, queste interazzione ponu esse bisognu di mudificazione post-traduzionale o stabilizazione da altre proteine ​​​​di sperma.In supportu di l'ultima ipotesi, i spermatozoi deficienti di IZUMO1 s'uniscenu à l'ovociti, dimustrendu chì e molécule altru ch'è IZUMO1 sò implicati in u passu di aderenza di gamete 27.
Parechje proteine ​​​​di fusione virali, cellulare è di sviluppu anu proprietà chì predicenu a so funzione cum'è fusogens.Ad esempio, le glicoproteine ​​di fusione virale (classi I, II e III) hanno un peptide di fusione idrofobica o un ciclo all'estremità della proteina che viene inserita nella membrana ospite.A mappa di l'idrofilia di IZUMO143 è a struttura (determinata è prevista) di a superfamiglia IST ùn mostrava alcun peptide di fusione idrofoba apparente.Cusì, se qualchì proteina in a superfamiglia IST funziona cum'è fusogens, facenu cusì in una manera diversa da altri esempi cunnisciuti.
In cunclusioni, e funzioni di i membri di a superfamiglia IST di proteini assuciati à a fusione di gameti restanu un misteru tentativu.A nostra molecula recombinante SPACA6 carattarizzata è a so struttura risolta darà una visione di e relazioni trà queste strutture spartute è u so rolu in l'attaccamentu è a fusione di gameti.
A sequenza di DNA chì currisponde à l'ectodominiu umanu SPACA6 previstu (numeru d'accessu NCBI NP_001303901.1; residui 27-246) hè stata ottimizzata per codon per l'espressione in cellule Drosophila melanogaster S2 è sintetizzata cum'è un frammentu di gene cù a sequenza codificante Kozak (Eurofin)., u signale di secrezione BiP è l'estremità 5' è 3' corrispondenti per a clonazione indipendente da a ligazione di stu genu in un vettore d'espressione pMT basatu annantu à un promotore di metallothionein mudificatu per a selezzione cù puromicina (pMT-puro).U vettore pMT-puro codifica un situ di scissione di trombina seguita da un tag 10x-His C-terminale (Figura S2).
A trasfezzione stabile di u vettore SPACA6 pMT-puro in e cellule D. melanogaster S2 (Gibco) hè stata realizata in modu simile à u protocolu utilizatu per IZUMO1 è JUNO43.I celi S2 sò stati scongelati è cultivati ​​in u mediu di Schneider (Gibco) supplementatu cù una cuncentrazione finale di 10% (v / v) di serum fetale inattivatu di calore (Gibco) è 1X antibioticu antimicoticu (Gibco).E cellule di passaghju iniziale (3.0 x 106 cells) sò state placcate in pozzi individuali di platti di 6 pozzi (Corning).Dopu à 24 ore d'incubazione à 27 ° C, e cellule sò state trasfettate cù una mistura di 2 mg di u vettore PACA6 pMT-puro è u reattivu di trasfezzione Effectene (Qiagen) secondu u protokollu di u fabricatore.I celluli trasfettati sò stati incubati per 72 ore è poi colti cù 6 mg / ml di puromicina.I celluli sò stati allora isolati da u mediu di Schneider cumpletu è posti in un mediu senza serum Insect-XPRESS (Lonza) per a produzzione di proteine ​​​​à grande scala.Un batch di 1 L di cultura di cellule S2 hè statu cultivatu à 8-10 × 106 ml-1 cellule in un fiascu Erlenmeyer di polipropilene a fondu flat ventilatu da 2 L è poi sterilizatu cù una cuncentrazione finale di 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) è filtratu sterile.induttu.I culturi induce sò stati incubati à 27 ° C. à 120 rpm per quattru ghjorni.
U mediu cundizionatu chì cuntene SPACA6 hè statu isolatu per centrifugazione à 5660 × g à 4 ° C seguita da un sistema di filtrazione di flussu tangenziale Centramate (Pall Corp) cù una membrana MWCO 10 kDa.Applica un mediu concentratu chì cuntene SPACA6 à una colonna di 2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen).A resina Ni-NTA hè stata lavata cù 10 volumi di colonna (CV) di buffer A è dopu 1 CV di buffer A hè stata aghjunta per dà una concentrazione finale di imidazole di 50 mM.SPACA6 hè statu eluutu cù 10 ml di buffer A supplementatu cù imidazole à una cuncentrazione finale di 500 mM.A trombina di classe di restrizzioni (Millipore Sigma) hè stata aggiunta direttamente à u tubu di dialisi (MWCO 12-14 kDa) à 1 unità per mg SPACA6 versus 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 è 150 mM NaCl (buffer B) per a dialisi.) à 4 ° C per 48 ore.U SPACA6 clivatu da a trombina hè stata diluita trè volte per riduce a cuncentrazione di sali è caricata nantu à una colonna di scambiu di cationi MonoS 5/50 GL da 1 ml (Cytiva / GE) equilibrata cù 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.U scambiatore di cationi hè stata lavata cù 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, dopu SPACA6 hè statu eluutu cù un gradiente lineare da 0 à 500 mm NaCl in 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 per 25 OK.Dopu à chromatografia di scambiu ionica, SPACA6 hè stata cuncintrata à 1 ml è eluted isocratically da un ENrich SEC650 10 x 300 culonna (BioRad) equilibrated cù buffer B. Sicondu u chromatogram, piscina è cuncentrazione fraccioni chì cuntenenu SPACA6.A purezza hè stata cuntrullata da l'elettroforesi macchiata di Coomassie nantu à un gel di poliacrilamide 16% SDS.A cuncentrazione di a proteina hè stata quantificata da l'assorbanza à 280 nm utilizendu a lege Beer-Lambert è u coefficiente teoricu di estinzione molare.
SPACA6 purificatu hè statu dializatu durante a notte contr'à 10 mM di fosfatatu di sodiu, pH 7,4 è 150 mM NaF è diluitu à 0,16 mg / mL prima di l'analisi per spettroscopia CD.A scansione spettrale di CD cù una lunghezza d'onda da 185 à 260 nm hè stata raccolta nantu à un spettropolarimetru Jasco J-1500 utilizendu cuvette di quartz cù una lunghezza di percorsu otticu di 1 mm (Helma) à 25 ° C à una velocità di 50 nm / min.I spettri CD sò stati curretti di basa, mediati nantu à 10 acquisti, è cunvertiti in ellitticità residuale media (θMRE) in gradi cm2 / dmol:
induve MW hè u pesu molekulari di ogni mostra in Da;N hè u numeru di aminoacidi;θ hè l'ellitticità in milligradi;d currisponde à a lunghezza di u percorsu otticu in cm;cuncentrazione di prutezione in unità.