304 Tubu in spirale saldatu in acciaio inox / tubu zomponent zhemical, Potenziale Biosinteticu di u Microbioma Marinu Globale

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Descrizzione dettagliata di u produttu

304 Tubu / tubu in spirale saldatu in acciaio inox
1. Specificazione: Tubu / tubu di bobina in acciaio inox
2. Tipu: saldatu o senza saldatura
3. Standard: ASTM A269, ASTM A249
4. Tubu bobina in acciaio inox OD: 6mm à 25.4MM
5. Lunghezza: 600-3500MM o cum'è per esigenza di u cliente.
6. Spessore muru: 0.2mm à 2.0mm.

7. Tolleranza: OD: +/-0.01mm;Spessore: +/-0,01%.

8. Bobina internu di u pirtusu: 500MM-1500MM (pò esse aghjustatu secondu i bisogni di u cliente)

9. Altezza di a bobina: 200MM-400MM (pò esse aghjustatu secondu i bisogni di u cliente)

10. Superficie: Bright o annealed
11. Material: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, alloy 625, 825, 2205, 2507, etc.
12. Imballaggio: sacchetti tissuti in casu di legnu, pallet di lignu, fustu di lignu, o cum'è u requisitu di u cliente
13. Test : cumpunente chimicu, forza di rendiment, forza di tensione, misurazione di durezza
14. Guarantee: L'ispezione di u terzu (per esempiu: SGS TV), etc.
15. Applicazione: Decorazione, mobili, trasportu d'oliu, scambiatore di calore, fabricazione di railing, fabricazione di carta, automobile, trasfurmazioni alimentari, medicale, etc.

E cumunità microbiche naturali sò filogenetiche è metabolicamenti diverse.In più di i gruppi d'urganismi sottostudiati1, sta diversità hà ancu un riccu potenziale per a scuperta di enzimi è composti biochimichi significativi ecologicamente è biotecnologici2,3.Tuttavia, studià sta diversità per determinà i percorsi genomici chì sintetizzanu tali composti è li liganu à i so ospiti rispettivi resta una sfida.U potenziale biosinteticu di i microorganismi in l'oceanu apertu resta largamente scunnisciutu per via di limitazioni in l'analisi di e dati di risoluzione di u genoma sanu à una scala globale.Quì, esploremu a diversità è a diversità di i gruppi di geni biosintetici in l'oceanu integrendu circa 10 000 genomi microbiani da cellule cultivate è cellule singole cù più di 25 000 genomi di bozza di novu ricustruitu da più di 1 000 campioni di acqua di mare.Questi sforzi anu identificatu circa 40 000 putativi, soprattuttu novi gruppi di geni biosintetici, alcuni di i quali sò stati trovati in gruppi filogenetici precedentemente insospettati.In queste pupulazioni, avemu identificatu un lignamentu arricchitu in clusters di geni biosintetici ("Candidatus Eudormicrobiaceae") chì appartene à un filum bacteriale incultu è includenu alcuni di i microorganismi più biosintetichi diversi in questu ambiente.Di questi, avemu carattarizatu i percorsi di fosfatasi-peptide è di pitonamide, identificendu casi di struttura di compostu bioattivu inusual è enzimologia, rispettivamente.In cunclusione, stu studiu dimostra cumu e strategie basate in microbioma ponu permette l'esplorazione di l'enzimi è l'alimenti naturali micca descritti prima in una microbiota è un ambiente pocu cunnisciuti.
I microbi guidanu i ciculi biogeochimici mundiali, mantenenu e rete alimentaria, è mantenenu e piante è l'animali sani5.A so enorme diversità filogenetica, metabolica è funziunale rapprisenta un riccu potenziale per a scuperta di novi taxa1, enzimi è composti biochimici, cumpresi i prudutti naturali6.In e cumunità ecologiche, queste molécule furnisce i microorganismi cù una varietà di funzioni fisiulogichi è ecologichi, da a cumunicazione à a cumpetizione 2, 7 .In più di e so funzioni originali, questi prudutti naturali è i so camini di produzzione codificati geneticamente furniscenu esempi per l'applicazioni biotecnologiche è terapeutiche2,3.L'identificazione di tali viaghji è cunnessione hè stata assai facilitata da u studiu di i microbi cultivati.Tuttavia, studii tassonomici di l'ambienti naturali anu dimustratu chì a maiò parte di i microorganismi ùn sò micca cultivati8.Stu preghjudiziu culturale limita a nostra capacità di sfruttà a diversità funzionale codificata da parechji microbi4,9.
Per superà queste limitazioni, l'avanzati tecnologichi di l'ultimi decennii anu permessu à i circadori di sequenza direttamente (vale à dì, senza cultura previa) frammenti di DNA microbicu da comunità intere (metagenomica) o cellule singole.A capacità di riunisce questi frammenti in frammenti di genoma più grande è ricustruisce più genomi assemblati metagenomicamente (MAG) o genomi amplificati unichi (SAG), rispettivamente, apre una opportunità impurtante per studii tassocentrichi di u microbioma (vale à dì, cumunità microbiche è u microbioma).aprenu novi chjassi.materiale geneticu propiu in un ambiente datu) 10,11,12.In effetti, studii recenti anu allargatu assai a rapprisintazioni filogenetica di a diversità microbica in a Terra1, 13 è anu revelatu assai di a diversità funzionale in e cumunità microbiche individuali chì ùn sò micca cuparti prima da sequenze di genoma di riferimentu di microorganismu cultivatu (REF)14.A capacità di mette una diversità funzionale scuperta in u cuntestu di u genoma di l'ospite (vale à dì, a risoluzione di u genoma) hè critica per predichendu linee microbiche ancora micca carattarizzate chì presumibilmente codificanu novi prudutti naturali15,16 o per rintracciate tali composti à u so pruduttore originale17.Per esempiu, un approcciu metagenomicu cumminatu è analisi genomica unicellulare hà purtatu à l'identificazione di Candidatus Entotheonella, un gruppu di batteri metabolicamente ricchi associati à spugna, cum'è pruduttori di una varietà di potenziali di droga18.Tuttavia, malgradu i recenti tentativi di esplorazione genomica di diverse comunità microbiche16,19, più di dui terzi di i dati metagenomici glubale per u più grande oceanu di ecosistemi di a Terra16,20 sò sempre mancanti.Cusì, in generale, u putenziale biosinteticu di u microbioma marinu è u so putenziale cum'è un repository di novi prudutti enzimatici è naturali restanu largamente sottumessi.
Per spiegà u putenziale biosinteticu di i microbiomi marini à una scala globale, avemu prima cumminatu i genomi microbichi marini ottenuti utilizendu metudi di cultura dipendente è micca di cultura per creà una vasta basa di dati di filogenetica è funzione genica.L'esame di sta basa di dati hà revelatu una larga varietà di clusters di geni biosintetici (BGC), a maiò parte di i quali appartenenu à famiglie di cluster di geni (GCF) ancora micca caratterizati.Inoltre, avemu identificatu una famiglia bacteriana scunnisciuta chì mostra a più alta diversità cunnisciuta di BGC in l'oceanu apertu finu à a data.Avemu sceltu dui percorsi di sintesi ribosomiale è di peptide modificatu post-traduzzione (RiPP) per a validazione sperimentale basatu annantu à e so differenze genetiche da i percorsi attualmente cunnisciuti.A caratterizzazione funziunale di sti camini hà revelatu esempi inespettati di enzimologia è cumposti strutturalmente inusuali cù attività inhibitoria di proteasi.
In prima, avemu u scopu di creà una risorsa di dati glubale per l'analisi di u genoma, cuncintratu nantu à i so cumpunenti bacteriali è archeali.Per questu scopu, avemu cumminatu dati metagenomici è 1038 campioni d'acqua di mare da 215 siti di campionamentu distribuiti globalmente (range di latitudine = 141,6 °) è parechji strati profondi (da 1 à 5600 m di prufundità, chì copre e zone pelagiche, mesopelagiche è abissal).Background21,22,23 (Fig. 1a, dati estesi, Fig. 1a è Supplementary Table 1).In più di furnisce una vasta cobertura geografica, sti campioni filtrati selettivamente ci anu permessu di paragunà diversi cumpunenti di u microbioma marinu, cumprese ricchi di virus (<0,2 µm), ricchi di procarioti (0,2–3 µm), ricchi di particelle (0,8 µm). ).–20 µm) et colonies appauvries par le virus (>0,2 µm).
a, Un totale di 1038 genomi dispunibuli publicamente (metagenomica) di e cumunità microbiche marine cullate da 215 lochi distribuiti in u mondu (62 ° S à 79 ° N è 179 ° W à 179 ° E.).Piastrelle di carte © Esri.Fonti: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ, è Esri.b, sti metagenomi sò stati utilizati per ricustruisce MAG (metudu è infurmazione supplementaria), chì sferiscenu in quantità è qualità (metudu) in i datasets (marcati in culore).I MAG ricostruiti sò stati supplementati cù genomi (esterni) dispunibuli publicamente, cumprese MAG26, SAG27 è REF artigianali.27 Cumpilà OMD.c, paragunatu à i rapporti precedenti basati solu nantu à SAG (GORG) 20 o MAG (GEM) 16, OMD migliurà a carattarizazione genomica di e cumunità microbiche marine (metagenomic read mapping rate; metudu) da duie à trè volte cù una rappresentazione più consistente in prufundità è latitudine..<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n=132, 30-60° , n = 73, > 60 °, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD raggruppamenti in u nivellu di clusters di spezie (95% identità media di nucleotidi) identifica un totale di circa 8300 spezie, più di a mità di e quali ùn sò micca state previamente carattarizatu da annotazioni tassonomiche chì utilizanu a GTDB (versione 89) e, a classificazione di e spezie per tipu di genoma hà dimustratu chì MAG, SAG è REF si cumplementanu bè in riflettendu a diversità filogenetica di u microbioma marinu.In particulare, 55%, 26% è 11% di e spezie eranu specifichi per MAG, SAG è REF, rispettivamente.BATS, Bermuda Atlantic Time Series;GEM, genomi di u microbioma di a Terra;GORG, genoma di riferenza di l'oceanu glubale;HOT, serie temporale di l'Oceanu Hawaiian.
Utilizendu stu dataset, avemu ricustruitu un totale di 26,293 MAG, soprattuttu bacterial è archeali (Fig. 1b è dati allargati, Fig. 1b).Avemu creatu questi MAG da assemblee da campioni metagenomici separati piuttostu cà cumulati per prevene u colapsu di a variazione di a sequenza naturale trà i campioni da diversi lochi o punti di tempu (metudi).Inoltre, avemu raggruppatu i frammenti genomici basati nantu à e so correlazioni di prevalenza in un gran numaru di campioni (da 58 à 610 campioni, secondu l'indagine; metudu).Avemu trovu chì questu hè un passu di tempu, ma impurtante24 chì hè statu saltatu in parechji travaglii di ricustruzzione MAG16, 19, 25 à grande scala è migliurà significativamente a quantità (2,7 volte in media) è a qualità (+ 20% in media) genoma.ricustruitu da u metagenome marinu studiatu quì (dati estesi, Fig. 2a è infurmazione supplementaria).In generale, sti sforzi anu risultatu in un aumentu di 4,5 volte in MAG microbiali marini (6 volte se sò cunsiderate solu MAGs d'alta qualità) cumparatu cù a risorsa MAG più cumpleta dispunibule oghje16 (Metodi).Stu set MAG di novu creatu hè statu dopu cumminatu cù 830 MAG26 scelti manualmente, 5969 SAG27 è 1707 REF.Vinti-sette spezie di battìri marini è archeea cumponenu una cullizzioni cumminatoria di 34 799 genomi (Fig. 1b).
Dopu avemu evaluatu a risorsa appena creata per migliurà a so capacità di rapprisintà e cumunità microbiche marine è valutà l'impattu di l'integrazione di diversi tipi di genoma.In media, avemu trovu chì copre circa 40-60% di dati metagenomic marini (Figura 1c), duie à trè volte a copertura di i rapporti MAG-solu precedenti in prufundità è latitudine More serial 16 o SAG20.Inoltre, per misurà sistematicamente a diversità tassonomica in e cullezzione stabilite, avemu annotatu tutti i genomi utilizendu u toolkit (metudi) di a basa di dati di Tassonomia Genomica (GTDB) è hà utilizatu una identità media di nucleotidi di u genoma di 95%.28 per identificà 8,304 raggruppamenti di spezie (spezie).Dui terzi di sti spezie (inclusi i novi cladi) ùn avianu micca apparsu in u GTDB, di quale 2790 sò stati scuperti cù u MAG ricustruitu in stu studiu (Fig. 1d).Inoltre, avemu trovu chì i diversi tipi di genomi sò assai cumplementarii: 55%, 26%, è 11% di spezie sò cumposti sanu sanu di MAG, SAG è REF, rispettivamente (Fig. 1e).Inoltre, MAG copre tutti i tipi di 49 truvati in a colonna d'acqua, mentri SAG è REF solu rapprisentanu 18 è 11 di elli, rispettivamente.In ogni casu, SAG rapprisenta megliu a diversità di i cladi più cumuni (data expanded, Fig. 3a), cum'è Pelagic Bacteriales (SAR11), cù SAG chì copre quasi spezie 1300 è MAG solu spezie 390.In particulare, i REF raramente si sovrapponevanu cù MAG o SAG à u livellu di spezie è rapprisentanu> 95% di i circa 1000 genomi chì ùn sò micca truvati in i setti metagenomici di l'oceanu aperti studiati quì, principalmente per l'interazzione cù altri tipi di specimens marini rapprisentanti isolati (per esempiu, sedimenti). .o l'associu host).Per fà esse largamente dispunibule à a cumunità scientifica, sta risorsa di genoma marinu, chì include ancu frammenti micca classificati (per esempiu, da fagi previsti, isule genomiche è frammenti di genomu per i quali ùn ci hè micca dati insufficienti per a ricustruzzione MAG), pò esse paragunatu cù dati tassonomici. .Accedi à l'annotazioni cù a funzione genica è i parametri contextuali in a basa di dati di Microbiologia di l'Oceanu (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Dopu avemu principiatu à spiegà a ricchezza è a novità di u putenziale biosinteticu in i microbiomi di l'oceanu aperti.À questu scopu, avemu prima utilizatu antiSMASH per tutti i MAG, SAG è REF truvati in 1038 metagenomi marini (metudi) per predichendu un totale di 39,055 BGC.Dopu avemu raggruppatu questi in 6907 GCF non ridondanti è 151 populazioni di cluster di geni (GCC; Tabella Supplementaria 2 è metudi) per cuntà a ridondanza inerente (vale à dì, u stessu BGC pò esse codificatu in più genomi) è dati metagenomici Frammentazione di BGC cuncentrati.I BGC incompleti ùn anu micca aumentatu significativamente, se esiste (Informazioni Supplementari), u numeru di GCF è GCC, rispettivamente, chì cuntenenu almenu un membru BGC intactu in 44% è 86% di i casi.
À u nivellu di GCC, avemu trovu una larga varietà di RiPP predichendu è altri prudutti naturali (Fig. 2a).Frà elli, per esempiu, arilpolieni, carotenoids, ectoines è siderophores appartenenu à i GCC cù una larga distribuzione filogenetica è una grande abbundanza in metagenomi oceanici, chì ponu indicà una larga adattazione di i microorganismi à l'ambiente marinu, cumprese a resistenza à e spezie reattive di l'ossigenu. stress ossidativu è osmoticu..o absorption di ferru (più infurmazione).Questa diversità funzionale cuntrasta cù una analisi recente di circa 1,2 milioni di BGC trà circa 190.000 genomi almacenati in a basa di dati NCBI RefSeq (BiG-FAM/RefSeq, in seguitu RefSeq)29, chì hà dimustratu chì i peptidi sintetasi non ribosomiali (NRPS) è polyketide synthase. (PKS) BGCs (Informazioni supplementari).Avemu trovu ancu 44 (29%) GCC solu distanti ligati à qualsiasi RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq> 0.4; Fig. 2a è metudi) è 53 (35%) GCC solu in MAG, mettendu in risaltu u putenziale. per detectà sustanzi chimichi precedentemente micca descritti in OMD.Siccomu ognuna di queste GCC rapprisentanu probabilmente funzioni biosintetiche assai diverse, avemu analizatu ulteriormente i dati à u livellu GCF in un sforzu di furnisce un raggruppamentu più detallatu di BGC previsti per codificà per prudutti naturali simili29.Un totale di 3861 (56%) identificati GCF ùn si sò micca sovrapposti cù RefSeq, è> 97% di GCF ùn eranu micca prisenti in MIBiG, una di e più grande basa di dati di BGC validati sperimentalmente (Figura 2b).Mentre ùn hè micca surprisante di scopre parechji percorsi novi potenziali in paràmetri chì ùn sò micca ben rapprisintati da u genoma di riferimentu, u nostru metudu per dereplicating BGCs in GCF prima di benchmarking difiere da i rapporti precedenti 16 è ci permette di furnisce una valutazione imparziale di novità.A maiò parte di a nova diversità (3012 GCF o 78%) currisponde à i terpeni previsti, RiPP o altri prudutti naturali, è a maiò parte (1815 GCF o 47%) hè codificata in tipi scunnisciuti per via di u so potenziale biosinteticu.A cuntrariu di i clusters PKS è NRPS, questi BGC compatti sò menu prubabilmente frammentati durante l'assemblea metagenomica 31 è permettenu una caratterizzazione funzionale più intensiva di tempu è risorse di i so prudutti.
Un totale di 39,055 BGC sò stati raggruppati in 6,907 GCF è 151 GCC.a, rapprisintazioni di dati (interna esterna).Raggruppamento gerarchico di distanze BGC basate su GCC, 53 di quali sono fissate da MAG solu.U GCC cuntene BGCs da diversi taxa (frequenza di porta trasformata in ln) è diverse classi BGC (taglia di u circulu currisponde à a so frequenza).Per ogni GCC, a capa esterna rapprisenta u numeru di BGC, a prevalenza (percentuali di campioni), è a distanza (distanza minima BGC cosenu (min(dMIBiG))) da BiG-FAM à BGC.I GCC cù BGC strettamente ligati à BGC verificati sperimentalmente (MIBiG) sò evidenziati cù frecce.b Paragunendu GCF cù BGC previsti (BiG-FAM) è validati sperimentalmente (MIBiG), 3861 novi (d–> 0.2) GCF sò stati trovati.A maiò parte (78%) di sti codice per RiPP, terpeni è altri prudutti naturali putativi.c, tutti i genomi in l'OMD truvati in 1038 metagenomes marini sò stati posti in l'arburu di basa GTDB per vede a cobertura filogenetica di l'OMD.Clades senza genomi in l'OMD sò mostrati in grisgiu.U numaru di BGCs currisponde à u più grande numaru di BGCs previsti per genoma in un clade datu.Per a clarità, l'ultimi 15% di i nodi sò colapsati.Le frecce indicano cladi ricchi di BGC (> 15 BGC), ad eccezione di Mycobacterium, Gordonia (secondo solo a Rhodococcus) e Crocosphaera (secondo solo a Synechococcus).d, inconnu c.Eremiobacterota hà dimustratu a più alta diversità biosintetica (indice di Shannon basatu annantu à u tipu di produttu naturali).Ogni banda rapprisenta u genoma cù u più BGC in a spezia.T1PKS, PKS tipu I, T2/3PKS, PKS tipu II è tipu III.
In più di a ricchezza è a novità, esploremu a struttura biogeugrafica di u putenziale biosinteticu di u microbioma marinu.U raggruppamentu di campioni per a distribuzione media di u numeru di copie GCF metagenomica (Metodi) hà dimustratu chì e cumunità di bassa latitudine, superficia, ricche di procarioti è poveri di virus, soprattuttu da superfici o acque più profonde, sò ricche di terpeni RiPP è BGC.In cuntrastu, e cumunità polari, di mare profonda, ricche di virus è di particelle sò assuciati cù abbundanza più altu di NRPS è PKS BGC (dati allargati, Fig. 4 è infurmazione supplementaria).Infine, avemu truvatu chì e cumunità tropicali è pelagiche ben studiate sò e fonti più promettenti di novi terpeni (Figura di Dati Aumentati).U più altu putenziale per PKS, RiPP è altri prudutti naturali (Figura 5a cù dati allargati).
Per cumplementà u nostru studiu di u putenziale biosinteticu di i microbiomi marini, avemu u scopu di cartografia a so distribuzione filogenetica è identificà novi clades arricchiti di BGC.À questu scopu, avemu postu i genomi di i microbes marini in un arbulu filogeneticu bacteriale è archeale normalizatu GTDB13 è sopra à i percorsi biosintetici putativi chì codificanu (Fig. 2c).Avemu facilmente rilevatu parechji cladi arricchiti di BGC (rappresentatu da più di 15 BGC) in campioni d'acqua di mare (metudi) cunnisciuti per u so potenziale biosinteticu, cum'è i cianobatteri (Synechococcus) è i batteri Proteus, cum'è Tistrella32,33, o recentemente attiratu l'attenzione per u so potenziale. prudutti naturali.cum'è Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus è Planctomycetota34,35,36.Curiosamente, avemu trovu parechji lignaggi inesplorati prima in questi cladi.Per esempiu, quelle spezie cù u potenziale biosinteticu più riccu in i phyla Planctomycetota è Myxococcota appartenevanu à ordini candidati è generi, rispettivamente (Tabella Supplementaria 3).Inseme, questu suggerisce chì l'OMD furnisce l'accessu à l'infurmazioni filogenetiche precedentemente scunnisciute, cumprese i microorganismi, chì ponu rapprisintà novi miri per a scuperta di l'enzimi è di i prudutti naturali.
In seguitu, avemu carattarizatu u clade arricchitu di BGC per ùn solu cuntà u numeru massimu di BGC codificati da i so membri, ma ancu per evaluà a diversità di questi BGC, chì spiega a freccia di diversi tipi di prudutti naturali candidati (Fig. 2c è metudi). )..Avemu trovu chì e spezie più biosintetiche diverse sò state rapprisentate da MAG batterii appositamente ingegneri in stu studiu.Queste bacteria appartenenu à u phylum incultu Candidatus Eremiobacterota, chì ferma largamente inesploratu fora di uni pochi studii genomici37,38.Hè da nutà chì "ca.U genus Eremiobacterota hè statu analizatu solu in un ambiente terrestre39 è ùn hè micca cunnisciutu chì includenu membri arricchiti in BGC.Quì avemu ricustruitu ottu MAG di a listessa spezia (identità di nucleotide > 99%) 23. Proponemu dunque u nome di spezia « Candidatus Eudoremicrobium malaspinii », chjamatu dopu à a nereide (ninfa di mare), un bellu rigalu in a mitulugia greca è in e spidizioni.'Ka.Sicondu l'annotazione filogenetica 13, E. malaspinii ùn hà micca parenti cunnisciuti prima sottu à u nivellu di sequenza è cusì appartene à una nova famiglia bacteriana chì prupunemu "Ca.E. malaspinii" cum'è a spezia tipu è "Ca.Eudormicrobiaceae "cum'è u nome ufficiale (Informazioni supplementari).Breve ricostruzione metagenomica di 'Ca.U prughjettu di u genomu di E. malaspinii hè statu validatu da un input assai bassu, una sequenza metagenomica di lettura longa è l'assemblea mirata di una sola mostra (Metodi) cum'è un unicu cromusomu lineale 9.63 Mb cù una duplicazione di 75 kb.cum'è l'unica ambiguità restante.
Per stabilisce u cuntestu filogeneticu di sta spezia, avemu cercatu 40 spezie strettamente correlate in campioni metagenomici arricchiti di eucarioti supplementari da a spedizione di l'Oceanu Tara attraversu a ricostruzione di genoma mirata.In breve, avemu ligatu letture metagenomiche à frammenti genomici assuciati cù "Ca.E. malaspinii" è ipotisatu chì una rata di reclutamentu aumentata in questa mostra indica a prisenza di altri parenti (metudu).In u risultatu, truvamu 10 MAG, una cumminazzioni di 19 MAG chì rapprisentanu cinque spezie in trè generi in una famiglia di novu definita (ie "Ca. Eudormicrobiaceae").Dopu l'ispezione manuale è u cuntrollu di qualità (dati allargati, Fig. 6 è infurmazioni supplementari), avemu trovu chì "Ca.E spezie Eudormicrobiaceae presentanu genomi più grandi (8 Mb) è un putenziale biosinteticu più riccu (14 à 22 BGC per spezia) cà l'altri membri "Ca".Clade Eremiobacterota (finu à 7 BGC) (Fig. 3a-c).
a, pusizioni filogenetiche di i cinque 'Ca.E spezie d'Eudormicrobiaceae anu mostratu una ricchezza BGC specifica per e linee marine identificate in stu studiu.L'arbulu filogeneticu include tutti i 'Ca.MAG Eremiobacterota è membri di altri phyla (numeri di genoma in parentesi) furniti in GTDB (versione 89) sò stati utilizati per u fondu evolutivu (Metodi).I strati più esterni rapprisentanu classificazioni à u livellu di a famiglia ("Ca. Eudormicrobiaceae" è "Ca. Xenobiaceae") è à u livellu di classi ("Ca. Eremiobacteria").E cinque spezie descritte in stu studiu sò rapprisentate da codici alfanumerichi è nomi binomiali pruposti (Informazioni Supplementari).b, ok.E spezie Eudormicrobiaceae sparte sette nuclei BGC cumuni.L'assenza di BGC in u clade A2 era dovuta à l'incompletezza di u MAG rappresentante (Tabella Supplementaria 3).I BGC sò specifichi per "Ca.Amphitomicrobium" è "Ca.Amphithomicrobiu" (cladi A è B) ùn sò micca mostrati.c, Tutti i BGC codificati cum'è "Ca.Eudoremicrobium taraoceanii hè stata trovata per esse espressa in 623 metatranscriptomes presi da l'oceani di Tara.Cerchi solidi indicanu a trascrizione attiva.I circles aranciu denote log2-trasformatu i cambiamenti di piega sottu è sopra à a tarifa di espressione genica di a casa (metudi).d, curve d'abbundanza relative (metudi) chì mostranu 'Ca.Spezie di Eudormicrobiaceae sò sparse in a maiò parte di i bacini di l'oceanu è in tutta a colonna d'acqua (da a superficia à una prufundità di almenu 4000 m).Basatu nantu à sti stimi, avemu trovu chì 'Ca.E. malaspinii' cuntene sin'à 6% di e cellule procariote in e cumunità di granu pelagicu di u mare profondu.Avemu cunsideratu una spezia per esse prisente in un situ s'ellu si trova in ogni frazzioni di a dimensione di una strata di prufundità data.IO - Oceanu Indianu, NAO - Atlanticu Nordu, NPO - Pacificu Nordu, RS - Mar Rossu, SAO - Atlanticu Sud, SO - Oceanu Meridionale, SPO - Pacificu Sud.
Studià l'abbundanza è a distribuzione di Ca.Eudormicrobiaceae, chì, cum'è avemu trovu, predomina in a maiò parte di i bacini di l'oceanu, è ancu in a colonna d'acqua sana (Fig. 3d).In u locu, custituiscenu u 6% di a cumunità microbica marina, facendu una parte impurtante di u microbioma marinu glubale.In più, avemu trovu u cuntenutu relative di Ca.E spezie Eudormicrobiaceae è i so livelli di espressione BGC eranu più altu in a fraccione arricchita eucariotica (Fig. 3c è dati estesi, Fig. 7), chì indicanu una interazzione pussibule cù a materia particulata, cumpresu u plancton.Questa osservazione porta una certa somiglianza cù 'Ca.Eudoremicrobium BGCs chì producenu prudutti naturali citotossichi attraversu percorsi cunnisciuti ponu esibisce un cumpurtamentu predatore (Informazioni Supplementari è Dati Espansi, Figura 8), simili à altri predatori chì producenu specificamente metaboliti cum'è Myxococcus41.A scuperta di Ca.Eudormicrobiaceae in menu dispunibuli (oceanu profondu) o eucarioti piuttostu cà campioni procarioti pò spiegà perchè sti batteri è a so diversità inaspettata di BGC ùn sò micca chjaru in u cuntestu di a ricerca di l'alimentariu naturali.
In ultimamente, avemu cercatu di cunvalidà sperimentalmente a prumessa di u nostru travagliu basatu in microbioma per scopre novi percorsi, enzimi è prudutti naturali.Trà e diverse classi di BGC, a via RiPP hè cunnisciuta per codificà una ricca diversità chimica è funziunale per via di diverse modificazioni post-traduzionali di u peptide core da enzimi maturi42.Allora avemu sceltu dui 'Ca.Les BGC RiPP d'Eudoremicrobium (Figures 3b et 4a-e) sont basées sur les mêmes BGC connus (\(\bar{d}\)MIBiG et \(\bar{d}\)RefSeq sopra 0.2).
a–c, Espressione eterologu in vitro è analisi enzimatici in vitro di un rumanzu (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) cluster di biosintesi RiPP specificu per spezie di Ca di mare profondu.E. malaspinii' hà purtatu à a pruduzzione di prudutti difosforilati.c, mudificazioni identificate cù MS / MS d'alta risoluzione (HR) (fragmentazione indicata da b è y ioni in a struttura chimica) è NMR (dati allargati, Fig. 9).d, stu peptide phosphorylate exhibe inibizione micromolar bassu di l'elastasi di neutrofili di mammiferi, chì ùn si trova micca in u peptide di cuntrollu è u peptide dehydrating (rimuzione chimica indotta a desidratazione).L'esperimentu hè ripetutu trè volte cù risultati simili.Per esempiu, l'espressione eterologa di un secondu rumanzu \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) cluster di biosintesi di proteine ​​​​elucida a funzione di quattru enzimi maturi chì mudificanu u peptide core di 46 aminoacidi.I residui sò macchiati secondu u situ di mudificazione previstu da HR-MS / MS, etichettatura isotopica è analisi NMR (Informazioni supplementari).A colorazione tratteggiata indica chì a mudificazione si trova in unu di i dui residui.A figura hè una compilazione di numerosi custruzzioni eterologi per vede l'attività di tutti l'enzimi maturi nantu à u stessu nucleu.h, Illustrazione di dati NMR per a N-metilazione di amide di spina.I risultati cumpleti sò mostrati in fig.10 cù dati allargati.i, A pusizione filogenetica di l'enzima di cluster di proteina FkbM matura trà tutti i domini FkbM truvati in a basa di dati MIBiG 2.0 revela una enzima di sta famiglia cù attività N-methyltransferase (Informazioni supplementari).I diagrammi schematici di BGC (a, e), strutture di peptidi precursori (b, f), è strutture chimiche putative di i prudutti naturali (c, g) sò mostrati.
A prima via RiPP (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) hè stata trovata solu in spezie di mare profonda "Ca.E. malaspinii "è codici per Peptide- precursor (Fig. 4a, b).In questa enzima matura, avemu identificatu un unicu duminiu funzionale omologu à u duminiu di disidratazione di lantipeptide sintasi chì normalmente catalizza a fosforilazione è a rimozione successiva di 43 (Informazioni supplementari).Dunque, predichemu chì a mudificazione di u peptide precursore implica una desidratazione in dui passi.In ogni casu, utilizendu spettrometria di massa tandem (MS / MS) è spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), avemu identificatu un peptide lineale polifosforilatu (Fig. 4c).Ancu s'ellu hè inespettatu, avemu truvatu parechje linee di evidenza per sustene u so esse u pruduttu finale: dui ospiti heterologhi diffirenti è senza desidratazione in test in vitro, identificazione di residui chjave mutati in u situ di disidratazione catalitica di l'enzima matura.tutti ricostruiti da "Ca".U genomu di E. malaspinii (dati allargati, Fig. 9 è infurmazione supplementaria) è, infine, l'attività biologica di u pruduttu fosforilatu, ma micca a forma desidratata sintetizzata chimicamente (Fig. 4d).In fatti, truvamu chì mostra una attività inhibitoria di proteasi micromolar bassu contru l'elastasi di neutrofili, paragunabili à l'altri prudutti naturali rilativi in ​​a gamma di cuncentrazione (IC50 = 14.3 μM) 44, malgradu u fattu chì u rolu ecologicu resta à esse elucidatu.Basatu nantu à questi risultati, prupunemu di chjamà a via "phospheptin".
U sicondu casu hè una via cumplessa RiPP specifichi à 'Ca.U genus Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) hè stata prevista per codificà i prudutti naturali di a proteina (Fig. 4e).Questi percorsi sò d'interessu biotecnologicu particulare per via di a densità prevista è a varietà di modificazioni chimiche inusual stabilite da l'enzimi codificati da BGCs45 relativamente brevi.Avemu trovu chì sta proteina difiere da e proteine ​​​​precedentemente carattarizzate in quantu ùn manca u mutivu principalu NX5N di polyceramides è u loop lanthionine di landornamides 46 .Per superà e limitazioni di mudelli d'espressione eterologi cumuni, l'avemu utilizatu inseme cù un sistema aerodenitrificans Microvirgula persunalizatu per caratterizà quattru enzimi di via matura (metudi).Utilizendu una cumminazzioni di MS / MS, etichettatura isotopica è NMR, avemu detectatu sti enzimi maturi in u core 46-aminoacidu di u peptide (Fig. 4f, g, dati expanded, Figs. 10-12 è infurmazione supplementaria).Frà l'enzimi maturi, avemu carattarizatu a prima apparizione di un membru di a famiglia di FkbM O-methyltransferase 47 in a via RiPP è inaspettatamente truvaru chì sta enzima matura introduce a spina N-methylation (Fig. 4h, i è infurmazione supplementaria).Ancu s'è sta mudificazione hè cunnisciuta in i prudutti naturali NRP48, a N-methylation enzimatica di i ligami amidi hè una reazione cumplessa ma biotecnologicamente significativa49 chì hè stata finu à avà d'interessu à a famiglia RiPP di borosi.Specificità 50,51.L'identificazione di sta attività in altre famiglie di enzimi è RiPP ponu apre novi applicazioni è espansione a diversità funziunale di e proteini 52 è a so diversità chimica.Basatu nantu à e mudificazioni identificate è a durata inusual di a struttura di u produttu pruposta, pruponemu un nome di strada "pythonamide".
A scuperta di una enzimologia inespettata in una famiglia di enzimi carattarizatu da funziunamentu illustra a prumessa di a genomica ambientale per novi scuperte, è illustra ancu a capacità limitata per l'inferenza funzionale basata solu in l'omologia di sequenza.Cusì, inseme cù rapporti di RiPP polifosforilati bioattivi non canonici, i nostri risultati dimustranu un valore intensivu di risorse, ma criticu per i sforzi di biologia sintetica per scopre cumplettamente a ricchezza funzionale, a diversità è e strutture inusuali di composti biochimici.
Quì avemu dimustratu a gamma di potenziale biosinteticu codificata da i microbi è u so cuntestu genomicu in u microbioma marinu glubale, facilitendu a ricerca futura mettendu a risorsa risultante dispunibule à a cumunità scientifica (https://microbiomics.io/ocean/).Avemu trovu chì gran parte di a so novità filogenetica è funziunale pò esse ottenuta solu ricustruendu MAG è SAG, in particulare in cumunità microbiche sottoutilizate chì puderanu guidà futuri sforzi di bioprospezione.Ancu s'ellu ci concentreremu quì nantu à 'Ca.Eudormicrobiaceae "cum'è un lignamentu soprattuttu biosinteticamente "talentu", assai di i BGC previsti in a microbiota scuperta prubabilmente codificanu enzymologies precedentemente micca descritte chì rendenu composti cù azioni ambientali è / o biotecnologichi significativi.
Insiemi di dati metagenomici da grandi studii oceanografichi è di serie temporali cù una prufundità di sequenza sufficiente sò stati inclusi per maximizà a copertura di e cumunità microbiche marine globali in bacini oceanici, strati profondi è in u tempu.Questi set di dati (Tabella Supplementaria 1 è Figura 1) includenu metagenomica da campioni raccolti in l'oceani di Tara (arricchiti virali, n = 190; arricchiti procarioti, n = 180) 12,22 è a spedizione BioGEOTRACES (n = 480).Hawaiian Oceanic Time Series (HOT, n = 68), Bermuda-Atlantic Time Series (BATS, n = 62)21 è l'Expedition Malaspina (n = 58)23.Sequencing reads from all metagenomic fragments sò stati filtrati per a qualità cù BBMap (v.38.71) sguassendu l'adattatori di sequencing da letture, sguassate letture mappate à sequenze di cuntrollu di qualità (genomi PhiX), è utilizendu trimq = 14, maq = 20 scarta a qualità di lettura povera, maxns = 0 è minlength = 45. L'analisi sussegwenti sò stati eseguiti o fusionati cù QC reads se specificatu (bbmerge.sh minoverlap = 16).E letture di QC sò state normalizzate (bbnorm.sh target = 40, minddepth = 0) prima di custruisce cù metaSPAdes (v.3.11.1 o v.3.12 se necessariu)53.I contigs di scaffold resultanti (in seguitu chjamati scaffolds) sò stati infine filtrati per lunghezza (≥1 kb).
I campioni metagenomici 1038 sò stati divisi in gruppi, è per ogni gruppu di campioni, i letture di cuntrollu di qualità metagenomica di tutti i campioni sò stati assuciati à i parentesi di ogni mostra separatamente, risultatu in u seguente numeru di letture di gruppi parentesi: Tara Marine Viruses - Arricchitu (190×190), Procarioti Arricchiti (180×180), BioGEOTRACES, HOT e BATS (610×610) e Malaspina (58×58).A cartografia hè stata fatta cù Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188) 54 chì permette à e letture per esse assuciatu à i siti secundari (usendu a bandiera -a).L'allineamenti sò stati filtrati per esse almenu 45 basi longu, avè ≥97% identità, è span ≥80% leghje.I schedarii BAM resultanti sò stati processati cù l'script jgi_summarize_bam_contig_depths per MetaBAT2 (v.2.12.1) 55 per furnisce una cobertura intra- è inter-sample per ogni gruppu.Infine, i brackets sò stati raggruppati per aumentà a sensibilità per eseguisce individualmente MetaBAT2 nantu à tutti i campioni cù -minContig 2000 è -maxEdges 500. Utilizemu MetaBAT2 invece di un boxer d'inseme perchè hè statu dimustratu in teste indipendenti per esse u boxer unicu più efficace.è da 10 à 50 volte più veloce di l'altri pugilati cumunimenti usati57.Per pruvà l'effettu di correlazioni di abbundanza, un sottocampione di metagenomica selezziunatu aleatoriamente (10 per ognunu di i dui datasets di Tara Ocean, 10 per BioGEOTRACES, 5 per ogni serie temporale, è 5 per Malaspina) hà ancu utilizatu campioni solu.I campioni interni sò raggruppati per ottene infurmazioni di copertura.(Informazioni supplementari).
Genomi supplementari (esterni) sò stati inclusi in l'analisi sussegwente, vale à dì 830 MAG selezziunati manualmente da un subset di u dataset Tara Oceans26, 5287 SAG da u dataset GORG20, è dati da a basa di dati MAR (MarDB v. 4) da 1707 REF isolati è 682 SAGs) 27. Per u dataset MarDB, i genomi sò selezziunati nantu à i metadati dispunibili se u tipu di mostra currisponde à l'espressione regulare seguente: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] isolatu'.
A qualità di ogni cuntinuu metagenomic è genomi esterni hè stata evaluata cù CheckM (v.1.0.13) è Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59.Se CheckM o Anvi'o segnala ≥ 50% di completezza / completezza è ≤ 10% di contaminazione / redundanza, allora salvà e cellule metagenomiche è genomi esterni per analisi più tardi.Questi punteggi sò stati cumminati in a completezza media (mcpl) è a contaminazione media (mctn) per classificà a qualità di u genoma secondu i criterii di a cumunità60 cum'è: alta qualità: mcpl ≥ 90% è mctn ≤ 5%;bona qualità: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, qualità media: mcpl ≥ 50% è mctn ≤ 10%, qualità ghjusta: mcpl ≤ 90% o mctn ≥ 10%.I genomi filtrati sò stati correlati cù i punteggi di qualità (Q è Q') cusì: Q = mcpl - 5 x mctn Q' = mcpl - 5 x mctn + mctn x (variabilità di strain) / 100 + 0.5 x log[N50] .(implementatu in dRep61).
Per permette l'analisi comparativa trà e diverse fonti di dati è i tipi di genoma (MAG, SAG è REF), i genomi 34,799 sò stati dereferenced basatu annantu à l'identità media di nucleotide (ANI) cù dRep (v.2.5.4).Ripetizioni)61 ​​cun 95% soglie ANI28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) è geni di marcatori di una sola copia chì utilizanu SpecI63 chì furnisce un clustering di genoma à u livellu di spezie.Un genoma rappresentativu hè statu sceltu per ogni cluster dRep secondu u puntu di qualità massima (Q') definitu sopra, chì era cunsideratu rapprisentivu di a spezia.
Per evaluà a velocità di mappatura, BWA (v.0.7.17-r1188, -a) hè stata utilizata per mape tutti i 1038 setti di letture metagenomiche cù 34,799 genomi cuntenuti in l'OMD.E letture cuntrullate da a qualità sò state mappate in modu unicu è l'allineamenti risultanti sò stati filtrati per mantene solu l'allineamenti ≥45 bp in lunghezza.è identità ≥95%.U rapportu di visualizazione per ogni mostra hè u percentuale di letture rimanenti dopu a filtrazione divisu da u numeru tutale di letture di cuntrollu di qualità.Utilizendu u stessu approcciu, ognunu di i metagenomi 1038 hè stata ridutta à 5 milioni d'inserzioni (dati espansi, Fig. 1c) è currisponde à GORG SAG in OMD è in tutti i GEM16.A quantità di MAGs recuperati da l'acqua di mare in u catalogu GEM16 hè stata determinata da e dumande di keyword di fonti metagenomiche, selezziunendu campioni di acqua di mare (per esempiu, in uppusizione à i sedimenti marini).In particulare, selezziunate "aquatic" cum'è "ecosystem_category", "marine" cum'è "ecosystem_type", è filtru "habitat" cum'è "deep ocean", "marine", "maritime oceanic", "pelagic marine", "marine water" , "Oceanu", "Acqua di mare", "Acqua di mare di superficie", "Acqua di mare di superficie".Questu hà risultatu in 5903 MAGs (734 d'alta qualità) distribuiti nantu à 1823 OTU (vedi quì).
I genomi procarioti sò stati annotati tassonomichi utilizendu GTDB-Tk (v.1.0.2) 64 cù paràmetri predeterminati destinati à a versione GTDB r89 13. Anvi'o hè stata utilizata per identificà i genomi eucarioti basati nantu à a predizione di dominiu è ricurdà ≥50% è redundancy ≤ 10%.L'annotazione tassonomica di una spezia hè definita cum'è unu di i so genomi rapprisentanti.Cù l'eccezzioni di l'eucarioti (148 MAG), ogni genoma hè statu prima annotatu funziunale cù prokka (v.1.14.5)65, nominando geni cumpleti, definendu parametri "archaea" o "bacteria" cum'è necessariu, chì hè ancu informatu per non- codifica di geni.e regioni CRISPR, trà altre caratteristiche genomiche.Annotate i geni previsti per l'identificazione di geni universali di marcatori di una sola copia (uscMG) cù fetchMG (v.1.2) 66, assignate gruppi ortologichi è dumanda cù emapper (v.2.0.1) 67 basatu in eggNOG (v.5.0) 68.A basa di dati KEGG (publicata u 10 di ferraghju di u 2020) 69. L'ultimu passu hè statu realizatu da currispondenza di proteine ​​​​à a basa di dati KEGG utilizendu DIAMOND (v.0.9.30)70 cù una dumanda è una copertura di tema di ≥70%.I risultati sò stati filtrati ulteriormente secondu a Pipeline di Annotazione di Genoma Procariotica NCBI71 basatu nantu à u bitrate ≥ 50% di u bitrate massimu previstu (link stessu).E sequenze di geni sò ancu utilizati com'è input per identificà BGC in u genoma utilizendu antiSMASH (v.5.1.0)72 cù paràmetri predeterminati è splusioni di cluster differenti.Tutti i genomi è l'annotazioni sò stati compilati in OMD inseme cù metadati contextuali dispunibili nantu à u web (https://microbiomics.io/ocean/).
Simile à i metudi descritti prima12,22 avemu utilizatu CD-HIT (v.4.8.1) per raggruppare> 56,6 milioni di geni codificanti di proteine ​​​​da genomi battìrichi è archeali da OMD in 95% d'identità è geni più brevi (90% coverage)73 finu à > 17,7 milioni di gruppi di geni.A sequenza più longa hè stata scelta cum'è u genu rappresentativu per ogni gruppu di geni.I metagenomi 1038 sò stati accumpagnati à> 17,7 milioni di membri di cluster BWA (-a) è i fugliali BAM risultanti sò stati filtrati per mantene solu allineamenti cù ≥95% per centu identità è ≥45 allineamenti di basa.L'abbundanza di geni nurmalizzati in lunghezza hè stata calculata cuntendu prima inserti da u megliu allineamentu unicu è dopu, per inserti fuzzy-mapped, aghjustendu cunti fraccionari à i geni di destinazione currispundenti proporzionali à u so numeru di inserti unichi.
I genomi da l'OMD allargatu (cù MAGs supplementari da "Ca. Eudormicrobiaceae", vede quì sottu) sò stati aghjunti à a basa di dati di strumenti di analisi metagenomica mOTUs74 (v.2.5.1) per creà una basa di dati di riferimentu mOTU estesa.Solu sei genomi di una sola copia (23,528 genomi) sopravvivevanu fora di deci uscMG.L'espansione di a basa di dati hà risultatu in 4,494 clusters supplementari à u livellu di spezie.1038 metagenomes sò stati analizati cù i paràmetri predeterminati di mOTU (v.2).Un totale di 989 genomi cuntenuti in 644 clusters mOTU (95% REF, 5% SAG è 99.9% appartenenti à MarDB) ùn sò micca stati rilevati da u prufilu mOTU.Questu riflette diverse fonti supplementari di isolamentu marinu di i genomi MarDB (a maiò parte di i genomi indetectati sò assuciati cù organismi isolati da sedimenti, ospiti marini, etc.).Per cuntinuà à fucalizza nantu à l'ambienti di l'oceanu apertu in stu studiu, l'avemu esclusu da l'analisi downstream, salvu chì ùn sò stati rilevati o inclusi in a basa di dati mOTU estesa creata in stu studiu.
Tutti i BGC da MAG, SAG è REF in OMD (vede sopra) sò stati cumminati cù BGC identificati in tutti i scaffolds metagenomici (antiSMASH v.5.0, paràmetri predeterminati) è carattarizatu cù BiG-SLICE (v.1.1) (domain PFAM)75.Basatu annantu à queste caratteristiche, avemu calculatu tutte e distanze cosenu trà BGC è raggruppati (ligami medii) in GCF è GCC utilizendu soglie di distanza di 0.2 è 0.8 rispettivamente.Queste soglie sò una adattazione di soglie aduprate prima utilizendu a distanza euclidea75 inseme cù a distanza cosenu, chì allevia una parte di l'errore in a strategia di clustering BiG-SLICE originale (Informazioni supplementari).
I BGC sò stati allora filtrati per mantene solu ≥5 kb codificati nantu à scaffolds per riduce u risicu di frammentazione cum'è descritta prima16 è per escludiri MarDB REF è SAGs micca truvati in 1038 metagenomes (vede sopra).Questu hà risultatu in un totale di 39,055 BGC chì sò codificati da u genoma OMD, cù un altru 14,106 identificatu nantu à frammenti metagenomici (vale à dì micca cumminati in MAG).Questi BGC "metagenomici" sò stati usati per stimà a proporzione di potenziale di biosintesi di microbioma marinu micca catturatu in a basa di dati (Informazioni supplementari).Ogni BGC hè stata carattarizatu funziunalmente secondu tippi di produtti predittivi definiti da categurie di prudutti anti-SMASH o più grossi definite in BiG-SCAPE76.Per prevene u preghjudiziu di campionamentu in quantificazione (composizione tassonomica è funzionale di GCC / GCF, distanza di GCF è GCC à basa di dati di riferimentu, è abbundanza metagenomica di GCF), mantenendu solu u BGC più longu per GCF per ogni spezia, 39,055 BGC sò stati ulteriormente deduplicati, in risultatu in un totale di 17,689 BGC.
A novità di GCC è GCF hè stata valutata nantu à a distanza trà a basa di dati calculata (base di dati RefSeq in BiG-FAM) 29 è a verificata sperimentalmente (MIBIG 2.0) 30 BGC.Per ognunu di i 17,689 BGCs rapprisentanti, avemu sceltu a distanza di cosenu più chjuca à a basa di dati rispettiva.Queste distanze minime sò allora mediate (media) secondu GCF o GCC, secondu apprupriatu.Un GCF hè cunsideratu novu se a distanza à a basa di dati hè più grande di 0,2, chì currisponde à una separazione ideale trà u GCF (media) è a riferenza.Per GCC, scegliemu 0.4, chì hè duie volte u limitu definitu da GCF, per chjude in una relazione à longu andà cù ligami.
L'abbundanza metagenomica di BGC hè stata stimata cum'è l'abbundanza media di i so geni biosintetici (cum'è determinatu da l'anti-SMASH) dispunibule da i profili à livellu di gene.L'abbundanza metagenomica di ogni GCF o GCC hè stata calculata cum'è a somma di BGCs rappresentativi (fora di 17,689).Queste carte d'abbundanza sò state dopu nurmalizate per a cumpusizioni cellulare utilizendu u conte di mOTU per mostra, chì hà ancu cuntatu per i sforzi di sequenza (dati allargati, Fig. 1d).A prevalenza di GCF o GCC hè stata calculata cum'è u percentualità di mostre cù una abbundanza> 0.
A distanza euclidea trà i campioni hè stata calculata da u prufilu GCF normalizatu.Queste distanze sò state ridotte in grandezza usendu UMAP77 è l'embedding risultanti sò stati aduprati per un clustering basatu in densità senza supervisione cù HDBSCAN78.U numeru minimu ottimali di punti per un cluster (è dunque u numeru di clusters) utilizatu da HDBSCAN hè determinatu da maximizà a probabilità cumulativa di appartenenza à u cluster.I clusters identificati (è un subsample aleatoriu equilibratu di questi clusters per cuntà u preghjudiziu in l'analisi multivariata permutazionale di a varianza (PERMANOVA)) sò stati pruvati per a significazione contr'à e distanze euclidiane senza riduzzione cù PERMANOVA.A dimensione media di u genoma di i campioni hè stata calculata basatu annantu à l'abbundanza relativa di mOTU è a dimensione di u genoma stimatu di i membri di i genomi.In particulare, a dimensione media di u genoma di ogni mOTU hè stata stimata cum'è a media di e dimensioni di u genoma di i so membri curretti per a completezza (dopu à u filtru) (per esempiu, un genoma cumpletu di 75% cù una lunghezza di 3 Mb hà una dimensione ajustata di 4). Mb).per genomi mediani cù integrità ≥70%.A dimensione media di u genoma per ogni mostra hè stata calculata cum'è a somma di e dimensioni di u genoma mOTU ponderate da l'abbundanza relativa.
Un inseme filtratu di BGC codificati in u genoma in l'OMD hè mostratu in arburi GTDB batterichi è archeali (in quadri ≥ 5 kb, escludendu REF è SAG MarDB micca truvatu in 1038 metagenomi, vede sopra) è e so categurie di produttu previste in basa di a filogenetica. pusizione di u genoma (vede sopra).Prima avemu riduciutu i dati per spezie, utilizendu u genoma cù u più BGC in quella spezia cum'è rappresentante.Per a visualizazione, i rapprisentanti sò stati ancu divisi in gruppi d'arburi, è dinò, per ogni clade cellula, u genoma chì cuntene u più grande numaru di BGC hè statu sceltu cum'è rappresentante.E spezie arricchite da BGC (almenu un genoma cù> 15 BGC) sò state analizate ulteriormente calculendu l'Indice di Diversità Shannon per i tipi di prudutti codificati in quelli BGC.Se tutti i tipi di prudutti previsti sò listessi, l'ibridi chimichi è altri BGC cumplessi (cum'è previstu da l'anti-SMAH) sò cunsiderati appartenenti à u stessu tipu di produttu, indipendentemente da u so ordine in u cluster (per esempiu, a fusione di proteina-bacteriocin è bacteriocin-proteoproteina). corpu).ibridu).
DNA restante (estimatu à 6 ng) da u campione Malaspina MP1648, currispondente à u campione biologicu SAMN05421555 è abbinatu à Illumina SRR3962772 set di lettura metagenomica per una lettura corta, processatu secondu u protocolu di sequenza PacBio cù input ultra-bassu per utilizà l'amplificazione di campionu gDNA di PacBio kit SMRTbell kit (100-980-000) è kit di preparazione di mudelli SMRTbell Express 2.0 (100-938-900).In breve, l'ADN restante hè statu tagliatu, riparatu è purificatu (perle ProNex) cù Covaris (g-TUBE, 52104).L'ADN purificatu hè allora sottumessu à a preparazione di libreria, amplificazione, purificazione (perle ProNex) è selezione di taglia (> 6 kb, Blue Pippin) prima di una fase finale di purificazione (perline ProNex) è sequenza nantu à a piattaforma Sequel II.
Ricustruzzione di i primi dui ca.Per MAG Eremiobacterota, avemu identificatu sei ANI supplementari> 99% (questi sò inclusi in a Figura 3), chì sò stati inizialmente filtrati in basa di punteggi di contaminazione (più tardi identificati cum'è duplicazioni di geni, vede sottu).Avemu trovu ancu una tavola marcata "Ca".Eremiobacterota" da diversi studii23 è l'hà utilizatu inseme à ottu MAG da u nostru studiu cum'è riferimentu per letture metagenomiche da 633 campioni eucarioti arricchiti (> 0,8 µm) cù BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, - una bandiera) per i campionamenti. mapping (5 milioni di letture).Basatu nantu à carte specifiche di arricchimentu (filtratu da identità di allineamentu 95% è copertura di lettura di 80%), 10 metagenomi (copertura prevista ≥5×) sò stati scelti per l'assemblea è 49 metagenomi supplementari (copertura prevista ≥1×) per a correlazione di cuntenutu.Utilizendu i stessi paràmetri cum'è sopra, sti campioni sò stati sbulicati è 10 'Ca's addiziunali sò stati aghjuntu.MAG Eremiobacterota hè stata restaurata.Questi 16 MAG (senza cuntà i dui dighjà in a basa di dati) portanu u numeru tutale di genomi in l'OMD allargatu à 34,815.I MAG sò attribuiti classi tassonomichi basati nantu à a so similitudine genomica è a pusizione in a GTDB.18 MAG sò stati dereplicati cù dRep in 5 spezie (ANI intraspecificu > 99 %) è 3 genri (ANI intragèneric 85 % à 94 %) in a stessa famiglia79.I rapprisentanti di spezie sò stati selezziunati manualmente nantu à l'integrità, a contaminazione è l'N50.A nomenclatura suggerita hè furnita in l'Informazioni Supplementari.
Valutà l'integrità è a contaminazione di 'Ca.MAG Eremiobacterota, avemu valutatu a prisenza di uscMG, è ancu di i geni di marcatori di una sola copia specifica di u lignamentu è di u duminiu utilizati da CheckM è Anvi'o.L'identificazione di 2 duplicati fora di 40 uscMGs hè stata cunfirmata da a ricustruzzione filogenetica (vede sottu) per escludiri qualsiasi contaminazione potenziale (questu currisponde à 5% basatu annantu à questi geni marcatori 40).Un studiu supplementu di cinque MAG rapprisentanti 'Ca.U bassu livellu di contaminanti in questi genomi ricostruiti hè statu cunfirmatu per e spezie Eremiobacterota utilizendu l'interfaccia interattiva Anvi'o basata in correlazioni di cumpusizioni di abbundanza è di sequenza (Informazioni supplementari)59.
Per l'analisi filogenemica, avemu sceltu cinque MAG rappresentativi "Ca".Eudormicrobiaceae", tutte e spezie "Ca.U genoma di Eremiobacterota è membri di altri phyla (inclusi UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria è Planctomycetota) hè dispunibule da GTDB (r89)13.Tutti questi genomi sò stati annotati cum'è descrittu prima per l'estrazione di geni di marcatore di copia unica è l'annotazione BGC.I genomi GTDB sò stati cunservati secondu i criteri di integrità è contaminazione sopra.L'analisi filogenetica hè stata realizata cù u flussu di travagliu Anvi'o Phylogenetics59.L'arbulu hè stata custruita cù IQTREE (v.2.0.3) (opzioni predeterminate è -bb 1000) 80 nantu à un allinamentu di 39 proteini ribosomal tandem identificati da Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551) 81.E so pusizioni sò state ridotte.per copre almenu 50% di u genomu82 è Planctomycecota hè stata utilizata cum'è un outgroup basatu annantu à a topologia di l'arburu GTDB.Un arbre di 40 uscMG hè statu custruitu cù i stessi arnesi è paràmetri.
Avemu usatu Traitar (v.1.1.2) cù paràmetri predeterminati (fenotipu, da i nucleotidi)83 per predichendu tratti microbiali cumuni.Avemu esploratu un potenziale stile di vita predatore basatu annantu à un indice predatore precedentemente sviluppatu84 chì dipende da u cuntenutu di un genu codificante di proteina in u genoma.In particulare, usemu DIAMOND per paragunà e proteine ​​​​in u genoma contr'à a basa di dati OrthoMCL (v.4)85 utilizendu l'opzioni -more-sensitive -id 25 -query-cover 70 -subject-cover 70 -top 20 AND count the genes currispundenti à i geni marcatori per i predatori è i non-predatori.L'indici hè a diffarenza trà u numeru di marcati predatori è non-predatori.Cum'è un cuntrollu supplementu, avemu ancu analizatu u genoma "Ca".U fattore Entotheonella TSY118 hè basatu annantu à a so associazione cù Ca.Eudoremicrobium (grande grandezza di genoma è potenziale biosinteticu).In seguitu, avemu pruvatu ligami potenziali trà i geni marcatori di predatori è non-predatori è u putenziale biosinteticu di Ca.Eudormicrobiaceae" è truvò chì micca più di un genu (da ogni tipu di genu marcatore, vale à dì u genu di predatore / non-predatore) si sovrappone cù BGC, suggerendu chì BGC ùn cunfunde micca i signali di predazione.L'annotazione genomica addiziale di repliconi scrambled hè stata realizata cù TXSSCAN (v.1.0.2) per esaminà specificamente u sistema di secrezione, pili è flagella86.
Cinque rapprisentanti 'Ca's sò stati mapping da mapping 623 metatranscriptomes da i fraccionari arricchimentu procariotic e eucariotic di l 'oceani Tara 22,40,87 (using BWA, v.0.7.17-r1188, -a flag).Genomu di Eudormicrobiaceae.I fugliali BAM sò stati processati cù FeatureCounts (v.2.0.1)88 dopu à 80% di copertura di lettura è 95% di filtru d'identità (cù l'opzioni featureCounts -primary -O -fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) Conta u numeru di inserti per genu.I mapei generati sò stati nurmalizzati per a lunghezza di u gene è l'abbundanza di u gene marcatore mOTU (contu di inserzione mediu normalizatu in lunghezza per i geni cù u conte di inserzione> 0) è log-trasformatu à 22.74 per ottene l'espressione relativa per cellula di ogni livellu di genu, chì spiega ancu u variabilità da mostra à mostra durante a sequenza.Tali rapporti permettenu l'analisi comparativa, mitigate i prublemi di cumpusizioni quandu si usanu dati di abbundanza relativa.Solu i campioni cù> 5 di i geni di marcatori 10 mOTU sò stati cunsiderati per più analisi per permettà una parte abbastanza grande di u genoma per esse rilevata.
U prufilu di transcriptome nurmalizatu di 'Ca.E. taraoceanii hè statu sottumessu à a riduzzione di dimensionalità cù UMAP è a rapprisintazioni resultanti hè stata aduprata per clustering unsupervised usendu HDBSCAN (vede sopra) per determinà u statu di espressione.PERMANOVA prova a significazione di e differenze trà i clusters identificati in u spaziu di distanza originale (micca ridutta).L'espressione differenziale trà queste cundizioni hè stata pruvata in u genoma (vede sopra) è 201 percorsi KEGG sò stati identificati in 6 gruppi funzionali, à dì: BGC, sistema di secrezione è geni flagellari da TXSSCAN, enzimi di degradazione (proteasi è peptidasi), è predatori è non-. geni predatori.marcatori d'indice predatori.Per ogni mostra, avemu calculatu l'espressione mediana normalizzata per ogni classa (nota chì l'espressione BGC stessa hè calculata cum'è l'espressione mediana di i geni biosintetici per quellu BGC) è pruvatu per a significazione in tutti i stati (test Kruskal-Wallis aghjustatu per FDR).
I geni sintetici sò stati acquistati da GenScript è i primers PCR sò stati acquistati da Microsynth.Phusion polimerasi da Thermo Fisher Scientific hè stata utilizata per l'amplificazione di DNA.I plasmidi NucleoSpin, u gel NucleoSpin è u kit di purificazione PCR da Macherey-Nagel sò stati usati per a purificazione di DNA.L'enzimi di restrizzioni è T4 DNA ligase sò stati acquistati da New England Biolabs.I chimichi altri chì isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Biosynth) è 1,4-dithiothreitol (DTT, AppliChem) sò stati acquistati da Sigma-Aldrich è utilizati senza più purificazione.L'antibiotici chloramphenicol (Cm), spectinomicin dihydrochloride (Sm), ampicillin (Amp), gentamicin (Gt) è carbenicillin (Cbn) sò stati acquistati da AppliChem.I cumpunenti di media Bacto Tryptone è Bacto Yeast Extract sò stati acquistati da BD Biosciences.A tripsina per a sequenza hè stata acquistata da Promega.
E sequenze di geni sò state estratte da BGC 75.1 previstu anti-SMASH.E. malaspinii (Informazioni supplementari).
I felici emba (locus, mana_samn05422137_metag-gene_5), immica, mana_ss.s47 (ampr) cù e exton ottimite a espressionale per spress quandu.U genu embA hè statu subclonatu in u primu situ di clonazione multipla (MCS1) di pACYCDuet-1 (CmR) è pCDFDuet-1 (SmR) cù siti di scissione BamHI è HindIII.I geni embM è embMopt (codon-optimized) sò stati subclonati in MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) cù BamHI è HindIII è posti in u sicondu situ di clonazione multipla di pCDFDuet-1 (SmR) è pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) cù NdeI/ChoI.A cassetta embAM hè stata subclonata in pCDFDuet1 (SmR) cù siti di scissione BamHI è HindIII.U genu orf3 / embI (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) hè statu custruitu da PCR di estensione di sovrapposizione utilizendu primer EmbI_OE_F_NdeI è EmbI_OE_R_XhoI, digeriti cù NdeI / XhoI, è ligati in u stessu p1CDFM in u stessu p1CDF. (Supplementariu table).6).A digestione di l'enzimi di restrizzioni è a ligazione hè stata realizata secondu u protocolu di u fabricatore (New England Biolabs).